[发明专利]一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及山葵遗传转化技术领域，特别公开一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法。

背景技术

山葵(Wasabi japonica Matsum)又名山嵛菜、山菜，为十字花科山嵛菜属多年生半阴生草本植物。山葵植物中含有一种芥子苷类的物质，在植物体被磨碎时，该物质在芥子苷酶的作用下水解形成异硫氰酸酯类化合物，其中尤以丙烯基异硫氰酸酯含量最高，约占89％～94％；另外，山葵植物还含有大量的氨基酸和各种人体需要的微量元素。由于山葵含有丰富的异硫氰酸酯类化合物和大量的人体需要的氨基酸和微量元素，其不仅具有强烈的辛辣味和特殊的香辛味，而且还具有免疫调节、抗菌、抗癌、抗氧化、抗血小板聚集等多种作用，是国际上公认的极为稀缺和珍贵的药食同源植物，被称为“绿色黄金”。

与其广泛的应用形成鲜明的对比，山葵资源十分有限，这是因为山葵植物的生长发育对环境有极为苛刻的要求，山葵适于在海拔高度为1000～2000米、温度范围为8～l8℃的潮湿凉爽的林中小溪生长。山葵生育温度一旦超过30℃易发生软腐病、黑心病、白粉病和病毒病，其中以软腐病和黑已病最为严重；但低于-3℃时又易受冻害；另外，山葵结实率低，种子休眠期长，其栽培地也不能连续种植；通常一株山葵植物经过18个月的栽种，收获的根茎平均不到200g。因此，目前仅靠山葵有限的栽种量，是远不能满足市场的需求。

专利CN1204453A公开了一种山葵种苗的快速繁殖方法，包括：无菌条件下切取山葵顶芽或根状茎上的侧芽，通过对培养基的选择、激素配比、培养条件的改变，进行试管苗诱导、试管苗的快速增殖培养、试管苗壮苗培养、生根培养、驯化移栽使山葵组培苗的增殖迅速，其繁殖系数能达到4.0-5.0，增殖培养形成的试管苗直接用于生产，省工省力、省地、速度快、降低生产成本。专利CN102668992A公开了一种山葵组培苗瓶外生根方法，其利用组织培养诱导山葵茎尖获得无根试管芽苗，在继代培养后，将芽苗经驯化切成单芽，再将芽苗插入土壤基质中，期间每周浇促根剂及1/2MS营养液一次，插入土壤基质30d后可获得较好的生根效果。专利CN102823491A公开了一种以山葵根为外植体的山葵愈伤组织培养方法，包括如下步骤：(1)外植体的处理：取从山葵植株剪下的山葵根，用流水冲洗干净后，放于滤纸上吸干表面水分，然后将其放在超净工作台上用浓度为0.1％～0.15％的升汞消毒5～8min，再用无菌水冲洗2～5次后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；(2)愈伤组织的诱导培养：将已消毒的山葵根切为1-2cm的长度，然后接入愈伤组织培养基MS+6-BA0.5～4.0mg·L^-1+2,4-D-1.0～6.0-mg·L^-1+IAA0.5～3.0mg·L^-1中进行诱导培养，培养条件为：温度10～28℃，每天光照4～10小时，光照强度为600～1200lx；(3)愈伤组织的增殖培养：将步骤(2)制得的愈伤组织转接入愈伤组织增殖培养基1/2MS+6-BA0～1.0mg·L^-1+2,4-D1.0～4.0mg·L^-1+KT0.5～1.0mg·L^-1+硫代硫酸钠0.5～4.0g·L^-1中进行增殖培养，培养条件为：温度10～28℃，每天光照6～12小时、光照强度为800～1500lx；上述所有培养基的pH值为5.6～6.5、蔗糖15～30g·L^-1、琼脂5.0～6.0g·L^-1。其通过将山葵根作为外植体接入愈伤组织培养基中进行培养，成功诱导出了有效成分含量高的山葵愈伤组织。专利CN103053426A公开了一种山葵幼苗培养方法，包括以下步骤：(A)生根培育：将经过灭菌脱毒初代培育的茎尖分生组织转移到不加激素的1/2MS培养基中生长；(B)移栽炼苗：步骤(A)持续28～32天后，将其移入到穴盘中；(C)大田种植：步骤(B)移栽炼苗75～85天后，将成品山葵幼苗移栽至大田。其采用在增殖培养的培养基中添加生根剂的方式来代替细胞分裂素，克服了生根较慢、根细长的问题，达到了短期内迅速增加单株苗的根长度的目的。专利CN103718963A公开了一种山葵脱毒苗的培养方法，其选用无菌的山葵芽体为培养材料，经变温处理后，取其芽分生组织接入丛生芽分化培养基中，再经壮苗培养基和生根培养基的诱导培养而获得山葵脱毒苗，所培养的山葵脱毒苗具有生长速度快、有效组分含量高等优点。