[发明专利]一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法

权利要求书

1.一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1，农杆菌菌种的活化培养：将发根农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养24～36h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃振荡培养1～2天后，用于外植体浸染；

步骤2，山葵无菌苗的获得：将山葵种子放在超净工作台上，先用75％的酒精消毒20～40s，再用0.1％升汞消毒3～8min，无菌水冲洗2～5次后，剥去种皮接种在培养基上培养，获得山葵无菌苗；

步骤3，山葵子叶的预培养：切取山葵无菌苗展开的子叶作为外植体，接种于预培养基上，并进行预培养；

步骤4，山葵子叶的遗传转化：选取预培养后的山葵子叶外植体放入步骤(1)活化好的农杆菌菌液中浸染，使外植体与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液后，再转入共培养基中，在15～22℃的暗培养条件下进行1～3d的共培养；随后将其转入抗生素水中浸泡后，再转入除菌培养基中进行除菌培养，每隔2～4d转接一次除菌培养基，直到毛状根大量产生；

步骤5，山葵毛状根的快速增殖：切取长度为1.5～3cm的毛状根转接在毛状根快速增殖培养基中培养。

2.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(1)中采用的农杆菌为发根农杆菌A4或R1000，浸染山葵子叶外植体的菌液OD₆₀₀＝0.1～0.3。

3.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(2)中将消毒后的山葵种子剥去种皮并接种在MS+6-BA0.5～4mg·L^-1+NAA(或者IAA)0.5～2mg·L^-1+蔗糖20～50g·L^-1+琼脂3.5～4.5g·L^-1的培养基上，并在22～28℃，光强1000～2000lx,每天光照8～12h的条件下培养，获得山葵无菌苗。

4.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(3)中，是选取山葵无菌苗刚展开1-4d的子叶作为外植体。

5.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(3)中，预培养基是MS+2，4-D1～2mg·L^-1+KT0.1～0.5mg·L^-1+腺嘌呤10～20mg·L^-1+蔗糖20～50g·L^-1+琼脂5～7g·L^-1。

6.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(3)中，山葵子叶的预培养条件是在18～22℃、无光照条件下进行1～3d的预培养。

7.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(4)中是选取预培养后在山葵子叶切口处产生膨大的外植体放入活化好的农杆菌菌液中浸染1～3分钟。

8.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(4)中的共培养基为1/2MS+邻苯二酚100～200mg·L^-1+蔗糖10～15g·L^-1+琼脂4～5.5g·L^-1；并在15～22℃的暗培养条件下进行1～3d的共培养。

9.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(4)中，把共培养后的外植体转入含头孢噻肟钠200～500mg·L^-1的抗生素水中浸泡1～3小时后，再转入除菌培养基为1/2MS+IBA0.1～0.5mg·L^-1+琼脂5～7g·L^-1+蔗糖15～30g·L^-1+头孢噻肟钠200～400mg·L^-1+头孢曲松钠200～400mg·L^-1中进行除菌培养。

10.根据权利要求1所述的一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤(5)中，毛状根快速增殖培养基为1/2MS+IBA0.1～0.5mg·L^-1+蔗糖10～20g·L^-1+头孢霉素100～300mg·L^-1的液体培养基上进行毛状根的快速增殖培养。