[发明专利]一种快速高通量检测细菌文库质粒大小的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物与新医药技术领域，具体涉及一种快速高通量检测细菌文库质粒大小的方法。

背景技术

随着测序技术的不断发展，越来越多的微生物基因组获得了完整的序列信息。而在这些研究领域，文库的构建成为其不可缺少的手段，尤其是实验室内部，通过构建各种不同大小的文库，进行功能片段的研究及测序，愈发显得重要。文库的群体大，往往需要覆盖物种基因组的2-3倍以上，可达上万个克隆，从文库中筛选不同大小的目标克隆，工作量巨大，难度也高。

常规的细菌如大肠杆菌重组质粒筛选方法有6种：(1)A互补。(2)插入失活。(3)菌落原位杂交。(4)限制性内切酶酶切反应。(5)菌落/菌液PCR法。(6)质粒抽提。前两种方法尽管操作简单但使用范围较窄，第三和第四种方法操作繁琐，且耗费资金。第五种方法易出现假阳性。第六种方法，耗时较长，且不能实现高通量。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种快速高通量检测细菌文库质粒大小的方法。

为了达到上述目的，本发明技术方案通过对细菌重组菌的4步处理：1)溶液I进行菌体悬浮；2)溶液II进行菌体裂解；3)溶液III除蛋白；4)DNA凝胶电泳，进行革兰氏阴性或阳性菌重组质粒大小的检测。

一种快速高通量检测细菌文库质粒大小的方法，具体步骤下：

1)菌体悬浮。利用溶液I在离心管中进行菌体悬浮。

溶液I的配方对于革兰氏阴性菌是25mMTris-HCl，25mMEDTA，0.02％(m/v)溴酚兰；对于革兰氏阳性菌是0.2％(m/v)溶菌酶，25mMTris-HCl，25mMEDTA，0.02％(m/v)溴酚兰。

2)菌体裂解。在步骤1)的离心管中加入溶液II，溶液II的配方是0.3MNaOH，2％(m/v)SDS，混匀后置于70℃水浴锅中水浴15分钟。

3)除蛋白。在步骤2)的离心管中加入溶液III，混匀后，12000rpm离心10分钟，溶液III的配方是苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)。

4)进行DNA凝胶电泳。取步骤3)中的离心上清液直接点样进行0.8％的DNA琼脂糖凝胶凝胶电泳即可判断重组质粒插入片段的大小。

根据以上方案，优选的，步骤1)中，在1.5ml离心管中加入12.5μl-25μl溶液I，并用灭菌中号移液器吸头从富集培养的平板上挑取10²-10⁵CFU/cm²的1平方厘米的菌体到上述离心管中，振荡器上振荡5秒混匀后，丢掉吸头。

优选的，步骤2)中，在步骤1)的离心管中加入6.25μl-12.5μl溶液II，轻轻颠倒混匀5秒。

优选的，步骤3)中，在步骤2)的离心管中加入5μl-10μl溶液III，混匀5秒。

优选的，步骤4)中，取步骤3)中的离心上清液10μl直接点样进行0.8％的DNA凝胶电泳，不必加上样缓冲液。

优选的，步骤2)中，菌体是革兰氏阳性菌时，先将步骤1)的离心管置于50℃水浴锅中水浴30分钟，再继续加入12.5μl溶液II。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明所述的快检的方法不需要提出质粒出来，4步就可以看到质粒的大小，同时可以检测到几十个质粒，只要跑胶槽数量足够，一次性可检测几时甚至上百个质粒。

2)本发明所述方法，步骤简单，便于操作；所需试剂量少，节约成本；时间快速，2小时内出鉴定结果；检测数量多，较短时间内一次性可以检测几十上百个样品，可以实现高通量。

3)常规质粒抽提试剂中没有加溴酚蓝检测试剂和溶菌酶，所以只能抽提革兰氏阴性菌如大肠杆菌，而且所需要的试剂体积也很多(一般都是100-200微升以上)，本发明方法是既可以检测阴性菌也可以检测阳性菌如芽胞杆菌，试剂用量少，才十几微升即可达到效果，简化了步骤，节约了试剂成本，达到高通量。

附图说明

图1为实施例1中获得的大肠杆菌质粒检测DNA凝胶电泳图谱。

泳道1-44(泳道4和28除外)：大肠杆菌文库转化子质粒

泳道4和28：lamdaHindIII双酶切DNAmarker

图2为实施例1中常规方法获得的大肠杆菌质粒检测DNA凝胶电泳图谱。

泳道1：lamdaHindIII双酶切DNAmarker

泳道2-5：大肠杆菌质粒

图3为实施例2中获得的苏云金芽胞杆菌质粒检测DNA凝胶电泳图谱。