[发明专利]苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护领域及分子生物学检测领域，具体地说，涉及苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法。

背景技术

在苹果栽培生产过程中，病毒病害一直是严重影响果品产量和品质的主要因素之一。苹果树被病毒侵染后，终生带毒，病毒在树体内增殖，干扰、破坏树体的正常生理机能，导致长势减退，产量下降，品质变劣，不耐贮藏，给我国的苹果生产造成了严重的经济损失。目前，我国已发现和鉴定的病毒主要包括：苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)、苹果凹果类病毒(Apple dimple fruit viroid,ADFVd)。前3种(ACLSV、ASGV、ASPV)为潜隐性病毒，侵染苹果树不引起明显症状，但导致树势衰弱，果实产量和品质严重下降；后2种(ASSVd和ADFVd)为类病毒，同为苹果锈果类病毒属(Apscarviroid)成员，在果实上表现锈果、花脸、凹陷等症状，严重降低果实经济价值，甚至完全丧失经济价值。ADFVd是于2013年在我国首次发现并报道的危险性类病毒，在我国苹果主产区山东和新疆局部发生，但有快速蔓延趋势。此外，日本学者报道了苹果皱果类病毒(AFCVd)的发生和危害，尽管AFCVd还未在我国发现，因其危害严重，有必要进行监测。

与其他病害相比，苹果病毒病的发生与危害有几大明显特点，一是多数为潜隐性发生，难以通过观察症状判断是否有病毒；二是类病毒对苹果果实危害严重，在枝条和幼树上无任何症状，经3～5年生长到了结果期，果实发病，果农损失惨重，所以育苗和生产中对苹果锈果类病毒属的3种类病毒应为零容忍；三是一旦被侵染，果树将终生带毒，受到长期且持续的危害；四是目前没有有效的药剂防治，特别是类病毒病发生后，应将病树刨除。这些特点给病害的诊断和控制造成了困难，在苹果嫁接生产过程中不能轻易分辨健康苗和带毒苗，容易造成带毒苗的乱用，使得后续病害大范围快速扩散。为此，亟待开发一种简单、快速、灵敏的检测方法用于检测苹果树和果实是否携带病毒和类病毒。

目前常见的检测病毒的方法有2种，一是以ELISA为主的血清学检测方法，因该方法灵敏度低，果树病毒含量低，该方法不适合苹果病毒的检测；二是常规PCR方法，由于侵染苹果的病毒种类多，需对每种病毒进行PCR检测，操作繁琐，耗时长，花费高。近些年逐渐发展起来的多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction)，由于可以在一个反应管中同时扩增多个序列，大大缩短了检测时间，实现了对多种病毒的同步检测，逐渐被广泛用于病毒病的检测工作中。相比常规PCR，多重PCR效率高，系统性强，节省了检测成本与检测时间，在果树病害的检测中多有报道，但没有关于同时检测3种潜隐病毒与苹果锈果类病毒属3种类病毒的相关文献和专利。

发明内容

本发明的目的是提供苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合。

本发明的另一目的是提供含有上述引物组合的用于多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒的试剂盒。

本发明的再一目的是提供苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法。

为了实现本发明目的，首先参考现有文献与GenBank中已报道的序列，筛选和设计多重RT-PCR引物，旨在使选择的引物可以适用于我国现有已确定的苹果所有潜隐病毒与类病毒，可特异地获得目标片段，且各目标片段可以用琼脂糖凝胶电泳清晰、明确地区分开。由于类病毒基因组较小(仅约330nt)，ASSVd、ADFVd、AFCVd同属Apscarviroid，且苹果栽培生产中，仅一种类病毒存在即引起严重危害，实际生产中不允许任一种类病毒存在，因此根据苹果锈果类病毒属3种类病毒设计通用引物检测3种类病毒。

本发明的苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合，所述引物组合包括：

用于特异性RT-PCR检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的引物对I：

ACLSV-F5′-GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3′

ACLSV-R5′-AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3′

其中，N为A或G，M为A或C；