[发明专利]苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法

权利要求书

1.苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

用于特异性RT-PCR检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus)的引物对I：

ACLSV-F 5′-GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3′

ACLSV-R 5′-AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3′

其中，N为A或G，M为A或C；

用于特异性RT-PCR检测苹果茎沟病毒(Apple stem grooving vir us)的引物对II：

ASGV-F 5′-TGGAAACCGAGGATGGACAG-3′

ASGV-R 5′-CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3′；

用于特异性RT-PCR检测苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus)的引物对III：

ASPV-F 5′-GAAGTAATCGCATCATTCAC-3′

ASPV-R 5′-GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3′；以及

用于特异性RT-PCR检测苹果锈果类病毒属(Apscarviroid)3种类病毒：苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid)、苹果凹果类病毒(A pple dimple fruit viroid)和苹果皱果类病毒(AFCVd)的通用引物对IV：

apscarviroids-F 5′-AGACCCTTCGTCGACGACGA-3′

apscarviroids-R 5′-TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3′。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合中还包括用于特异性RT-PCR检测内参基因ER-1α的引物对V：

ER-1α-F 5′-TCATCATGAACCACCCCG-3′

ER-1α-R 5′-CCTGTCCAGAACCCAATTC-3′。

3.含有权利要求1或2所述引物组合的用于多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录酶、RNase抑制剂、DNaseⅠ、DEPC水、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

6.权利要求3-5任一项所述试剂盒在多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒中的应用。

7.苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测苹果样品中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链；

2)以步骤1)中获得的cDNA为模板，利用权利要求2所述引物组合进行特异性PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：提取待测苹果样品中的总RNA，向反应管中加入苹果样品RNA3.5μL、10μM随机引物0.5μL、10μM Oligo dT0.5μL、5×M-MLV酶缓冲液4.0μL、10mM dNTPs1.0μL、RNA酶抑制剂0.5μL、200U/μL M-MLV反转录酶0.5μL，加DEPC ddH₂O至总体积20μL，于42℃反应1h，即得第一条cDNA链。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行PCR扩增使用的PCR反应体系以25μl计为：

PCR反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，53℃45秒，68℃2分钟，共35个循环；72℃10分钟。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，待测苹果样品来自于苹果的叶片、枝条、花或果实。