[发明专利]一种硫酸脂化聚蔗糖及其应用

说明书

技术领域

本发明属于水包油佐剂技术领域，具体涉及一种硫酸脂化聚蔗糖及其应用。

背景技术

目前油乳剂疫苗有三种剂型：油包水(W/O)型、水包油包水(W/O/W)型和水包油(O/W)型。W/O免疫活性最强，但毒副反应大、注射困难；W/O/W免疫活性也较强，但热稳定性差、保存期短；O/W毒副作用小甚至没有、热稳定性好，但是免疫活性较弱。MF59是首个实现商品化应用的O/W剂型佐剂，用其制备的人用流感疫苗在欧洲和美国获得上市。该佐剂的油为角鲨烯，具有安全、毒副作用极小等优点，表面活性剂为吐温和司本系列产品。但是，该佐剂的免疫活性相对较弱，仅能协助诱导微弱弱的免疫应答，尚不能满足养兽用疫苗的质量要求。另外，角鲨烯(或其类似物角鲨烷)的价格昂贵，也很难在兽用疫苗产品中广泛应用。法国SEPPIC公司用白油替代角鲨烯，用吐温和司本系列产品作为表面活性剂开发了一种O/W佐剂(ISA15A VG)，但也因为免疫活性较弱，未能实现商业化应用。

多糖的糖残基上有大量羟基、羧基和氨基等活性基团，方便化学反应进行耦合添加其它分子物质，制备各种衍生物。研究发现，应用氯磺酸对多糖进行磺化，可以获得硫酸化多糖衍生物，修饰后多糖的免疫增强效果明显提高，并且提高多糖的水溶性，提高生物利用度。应用酯化反应也能将脂肪链耦合到多糖的羟基上，形成含脂肪链的酯化多糖衍生物，提高多糖的脂溶性。Jansze等人运用化学的方法，可以将硫酸基和脂链共价耦合到葡聚糖上，获得既亲水又亲油的硫酸脂化葡聚糖衍生物。Hilgers等人将其作为一种表面活性剂，与其它表面活性剂配伍使用，制备出角鲨烯的水包油乳液，并在以OVA为抗原的小鼠免疫试验中，表现出较好的免疫效果。同时还发现硫酸基取代值小、脂化度大的多糖衍生物佐剂活性较大。提示，经过硫酸化和脂化双重修饰后的多糖，同时具有亲水和亲油基团，具备双亲功能，使有免疫增强活性的多糖同时拥有表面活性剂的双重功能。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种硫酸脂化聚蔗糖，硫酸度低、脂化度高。本发明的另一目的是提供一种上述硫酸脂化聚蔗糖的水包油佐剂应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种硫酸脂化聚蔗糖，由以下步骤制备而成：

1)取干燥的聚蔗糖溶解于二甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得聚蔗糖溶液；取月桂酰氯溶解于二甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得月桂酰氯溶液；取氯磺酸溶解于二甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得氯磺酸溶液；

2)将月桂酰氯溶液与聚蔗糖溶液混合，先在60～80℃下反应，然后室温孵育；

3)取氯磺酸溶液与步骤2)所得的溶液混合，先在60～80℃下反应，然后室温孵育；

4)将步骤3)中的反应液用NaOH溶液调pH至中性，蒸馏去除溶剂，洗涤、透析除去杂质，干燥获得硫酸脂化聚蔗糖；

其中，月桂酰氯与聚蔗糖的分子比为：1.2～3.6:1；氯磺酸与聚蔗糖的分子比为：0.5～2.0:1。

所述的月桂酰氯与聚蔗糖的分子比为3.6:1，氯磺酸与聚蔗糖的分子比为1:1。

步骤2)和步骤3)的反应温度均为60℃。

所述的硫酸脂化聚蔗糖的脂化度和硫酸取代度分别为1.70和1.32。

所述的硫酸脂化聚蔗糖在制备水包油佐剂中的应用。

本发明的硫酸脂化聚蔗糖一种应用方法是：取1.0g的硫酸脂化聚蔗糖，溶于2.0g的Tween80中，制备成硫酸脂化聚蔗糖的Tween80溶液；缓慢加入80mL的注射用水，制成硫酸脂化环糊精Tween80水溶液；加入8.0g白油。高压均质机乳化，400bar，温度30～40℃，10个循环以上，过滤除菌而成。

本发明利用月桂酰氯、氯磺酸等化学试剂，先脂化再硫酸化，建立一种聚蔗糖的硫酸脂化衍生物的制备方法。并通过O/W乳液热稳定性、离心稳定性和免疫生物活性的比较研究，对硫酸脂化聚蔗糖制备过程中试剂的比例、温度等合成条件参数进一步优化，成功的建立了一种活性最佳的硫酸脂化聚蔗糖制备方法。并且将该硫酸脂化聚蔗糖与吐温80配伍，以白油为油相，通过高压均质法制备出热稳定性和离心稳定性均合格O/W乳液。同时以猪圆环病毒2型(PCV-2)为模式抗原，通过体内免疫试验测评，该佐剂的免疫增强活性显著优于进口产品ISA15A VG。成功地解决了O/W剂型佐剂免疫活性较弱、不能满足兽用疫苗质量要求的难题，可以用于PCV-2等兽用疫苗的生产。