[发明专利]EHNV抗血清的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及水生动物疾病防治领域，具体而言，涉及EHNV抗血清的制备方法及其应用。

背景技术

流行性造血器官坏死病(EHN)为世界动物卫生组织(OIE)公布的鱼类必报疫病，该病在我国《进境动物检疫疫病名录》中被列为二类传染病。

目前，在国内外，EHN的诊断方法主要有以下几种：病毒分离、免疫过氧化物酶试验、抗原捕捉ELISA、免疫电镜和PCR等。其中，病毒分离为最常用方法，分离病毒主要采用PCR技术进行鉴定。

另外，ELISA等免疫学鉴定方法也是较为常用且被《水生动物疫病诊断手册》所推荐使用的一种测定方法，该方法在测定的过程中需要各种EHN免疫学诊断试剂(主要为EHNV抗血清)，而国内市场上没有这些试剂(尤其是EHNV抗血清)，主要依靠进口，价格昂贵、成本高，不利于EHN免疫学诊断方法的推广使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EHNV抗血清的制备方法，以解决上述的技术问题。

在本发明的实施例中提供了EHNV抗血清的制备方法，包括以下步骤：

在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液，吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养，得到病变细胞液；

将所述病变细胞液于10000×g-14000×g离心25-35min，得到第一上清液和第一沉淀；

将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和35-37℃水浴反复冻融3-4次，再进行超声波粉碎3-4次后，于6000×g-7000×g离心10-20min，得到第二上清液；

将所述第一上清液和所述第二上清液合并后于8000×g-12000×g离心7-9h，得到第二沉淀；

将所述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液；

利用蔗糖密度梯度离心法将所述重悬病毒液进行纯化，得到纯化后病毒；

以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述血样于35-37℃温箱放置1-2h后，4℃放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心8-12min，得到EHNV抗血清；

本发明提供的这种EHNV抗血清的制备方法，其实现了EHNV抗血清的制备，在该方法中，采用了低速长时离心方法，获得了高浓度EHNV(纯化后病毒)，将其作为抗原，对实验动物进行免疫操作，为制备特异性强和效价高的抗血清奠定了基础。

通过实验验证，本发明提供的这种EHNV抗血清的制备方法，其制备得到的纯化后病毒浓度可以达到32mg/mL，通过免疫之后，获得的EHNV抗血清的效价可达到1:204800。通过该方法实现了高效价EHNV抗血清的制备，获得的抗血清可以应用到EHNV免疫过氧化物酶检测方法中，为EHN过氧化物酶、酶联免疫吸附试验等免疫学诊断方法提供诊断试剂，克服了现有技术中EHN免疫学诊断试剂，主要依靠进口、成本高，进而不利于EHN免疫学诊断方法的推广使用的技术缺陷。解决了我国EHNV检测技术中免疫学诊断试剂高度依赖进口、检测成本高等问题，进而有利于EHNV免疫学诊断方法的推广使用

可选的：在所述在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液，吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养，得到病变细胞液的步骤中：

所述敏感细胞为CHSE-214、鲈鱼鳃细胞系、胖头鱥肌肉细胞系或鲤上皮瘤细胞系；

在所述吸附的过程中，吸附的温度为12-18℃、所述预定时间为50-70min。

可选的，在所述在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养，得到病变细胞液的步骤中；

所述M199培养基中含体积份数为2％的胎牛血清。

可选的，在所述将所述病变细胞液于10000×g-14000×g离心25-35min，得到第一上清液和第一沉淀的步骤中：

所述离心的温度为4℃。

可选的，在所述将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和35-37℃水浴反复冻融3-4次，再进行超声波粉碎3-4次后，于6000×g-7000×g离心10-20min，得到第二上清液的步骤中：

每次所述超声波粉碎所用的时间为50-70秒。

可选的，在所述将所述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液的步骤中；所述Tris-HCl的浓度为100mM、pH为8.6。