[发明专利]EHNV抗血清的制备方法及应用

权利要求书

1.一种EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液，吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养，得到病变细胞液；

将所述病变细胞液于10000×g-14000×g离心25-35min，得到第一上清液和第一沉淀；

将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和35-37℃水浴反复冻融3-4次，再进行超声波粉碎3-4次后，于6000×g-7000×g离心10-20min，得到第二上清液；

将所述第一上清液和所述第二上清液合并后于8000×g-12000×g离心7-9h，得到第二沉淀；

将所述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液；

利用蔗糖密度梯度离心法将所述重悬病毒液进行纯化，得到纯化后病毒；

以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述血样于35-37℃温箱放置1-2h后，4℃放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心8-12min，得到EHNV抗血清。

2.根据权利要求1所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养，得到病变细胞液的步骤中：

所述敏感细胞为CHSE-214、鲈鱼鳃细胞系、胖头鱥肌肉细胞系或鲤上皮瘤细胞系；

在所述吸附的过程中，吸附的温度为12-18℃、所述预定时间为50-70min。

3.根据权利要求1所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述在新培养的敏感细胞中加入EHNV病毒液吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养，得到病变细胞液的步骤中；

所述M199培养基中含体积份数为2％的胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述将所述病变细胞液于10000×g-14000×g离心25-35min，得到第一上清液和第一沉淀的步骤中：

所述离心的温度为4℃。

5.根据权利要求1所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和35-37℃水浴反复冻融3-4次，再进行超声波粉碎3-4次后，于6000×g-7000×g离心10-20min，得到第二上清液的步骤中：

每次所述超声波粉碎所用的时间为50-70秒。

6.根据权利要求1-5任一项所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述将所述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液的步骤中；

所述Tris-HCl的浓度为100mM、pH为8.6。

7.根据权利要求6所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述血样于35-37℃温箱放置1-2h后，4℃放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心8-12min，得到EHNV抗血清的步骤中：

所述实验动物包括新西兰大耳白兔、小鼠、山羊或绵羊中的一种。

8.根据权利要求7所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述血样于35-37℃温箱放置1-2h后，4℃放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心8-12min，得到EHNV抗血清的步骤中，相邻两次免疫的时间间隔为3周。

9.权利要求1-8任一项所述的EHNV抗血清的制备方法获得的EHNV抗血清。

10.权利要求1-8任一项所述的EHNV抗血清的制备方法获得的EHNV抗血清在EHNV免疫过氧化物酶检测方法中的应用。