[发明专利]DTT处理结合CHIP与EMSA体内外分析拟南芥HSF1三聚体形成的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体而言，涉及DTT处理结合CHIP与EMSA体内外分析拟南芥HSF1三聚体形成的方法。 

背景技术

植物热激因子(heat shock transcription factor，HSF)是真核生物热激反应的主要转录调控因子，它属于一类在真核细胞领域保守的蛋白家族。目前对植物HSF的研究主要是以模式植物拟南芥为对象，在拟南芥中存在21个HSFs的同源体，组成HSF家族。虽然目前对绝大多数同源体的功能还不了解，但研究显示其中HSF1是与耐逆境有关的主要调控因子^[7-9]，对HSF1境信号转导机理研究显示，与大多数HSF相似，在非逆境条件下，HSF1以非活性的单体形式存在，逆境诱导HSF1单体形成三聚体(活性)、与靶DNA启动子区HSE(5'-nGAAnnTTCnnGAAn-3')特异性结合，从而调控逆境防御基因的表达。然而，不清楚AtHsfA1三聚体是如何形成而调控逆境防御基因表达，研究热激因子三聚体形成的化学本质与机理是未来研究的发展趋势。对哺乳动物HSF1的基因进行定点突变研究发现：HSF1由单体转化为多聚体活化形式需要两个较保守的半胱氨酸残基，这两个半胱氨酸在氧化条件下可形成二硫键，暗示不同逆境信号诱导热激因 子形成三聚体可能是通过半胱氨酸氧化作用。然而不清楚拟南芥HSF1感应逆境形成三聚体是否也是通过半胱氨酸氧化作用。研究显示HSF1的寡聚域(HR-A/B)中含有1个半胱氨酸(Cys)，HSF1三聚体与二硫键的关系是目前研究的热点。在以往的研究中，关于蛋白质分子间的研究方法包括生物化学、生物物理学、遗传学和计算机等领域的方法。所涉及的尖端技术包括表面质粒共振技术、荧光共振能量转移、荧光极化、等温滴定量热法、圆二色分析、蛋白质片段补充试验、各种双杂交系统，以及蛋白质组方法和生物信息学方法。对于二硫键的研究方法主要采用物理化学的方法结合生物信息学进行分析，早期确证二硫键配对方式，是通过HPLC肽谱比较还原性与非还原性酶解后的肽段混合物，找出并收集差异峰，通过氨基酸组成分析或N端测序来确定肽段序列，并推测二硫键的配对方式。该方法过程繁琐，精确度低，成功率低，很难确定复杂蛋白质样品的二硫键配对方式。后来随着质谱的出现，应用MALDI-TOF分析还原性与非还原性酶解后的肽段混合物的质量肽谱图，确定二硫键相连肽段的分子量，从而推测二硫键配对方式。该法找到的肽段覆盖率较低，约为40％左右，只能找到少数的二硫键。另外，该法处于一级质谱水平，可信度大打折扣。目前应用更先进的液质联用质谱技术与多酶解相结合，通过串联质谱技术，对找到的二硫键链接的肽段进行二级质谱分析，提高了覆盖率到90％左右，从而显著提高了找到二硫键的机会，但这种研究方法仅从分子结构的角度去验证,由于生物分子结构的复杂性,导致实验的难度增大。本方法采用分子生物学的方法，采用二硫键的还原剂二硫 苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)进行处理HSF1后，从热激因子HSF1体内外的生物学功能来推测其三聚体是否形成，如何形成。体内研究HSF1的生物学功能采用染色质免疫沉淀技术，其染色质免疫沉淀技术的基本原理是在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA共价交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体，用Protein-A/G-Agarose/Sepharose特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，用不含Dnase的Rnase和ProteinaseK解除交联，纯化DNA，通过对目的片断的检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。此方法可以克服体外研究DNA-蛋白质相互作用的局限，具体表现在以下几个方面：首先，每次分离转录调控蛋白结合的靶DNA片段，不仅能得到一些亲和力高的DNA片段，还能富集亲和力弱的靶DNA片段。其次体内蛋白质与DNA的结合可以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，找出在生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。体外研究HSF1的生物学功能采用电泳迁移率变动分析(EMSA)又称为凝胶阻滞分析，它是一种在体外证实目的蛋白与靶DNA直接结合的方法。在EMSA中，目的蛋白与生物素标记的靶DNA混合后，用电泳分离，如果目的蛋白结合于靶DNA，电泳带移动将会缓慢。二硫苏糖醇处理后，从生物学功能的角度结合染色质免疫沉淀技术(CHIP)与电泳迁移率变动分析(EMSA)体内外研究HSF1的活性状态，从而揭示三聚体形 成与二硫键的关系。这种方法可以把拟南芥热激转录因子HSF1结构和功能有效的结合，是研究HSF1三聚体形成的有效方法。