[发明专利]DTT处理结合CHIP与EMSA体内外分析拟南芥HSF1三聚体形成的方法

权利要求书

1.一种DTT处理结合CHIP与EMSA体内外分析拟南芥热激转录因子HSF1三聚体形成的方法，其特征在于，包括如下步骤： 

步骤一、逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSF1； 

步骤二、DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗和纯化的蛋白； 

步骤三、将上述各种体内逆境处理和未处理的小苗用甲醛交联和染色质免疫沉淀技术，获得染色质免疫沉淀DNA； 

步骤四、利用电泳迁移率变动分析EMSA研究不同逆境在体外对HSF1的激活。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSF1的具体步骤为： 

逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSF1： 

(1.1)逆境处理拟南芥小苗： 

取生长4周的小苗放入培养buffer中进行以下逆境处理： 

(1)热激处理：39℃水浴中震荡培养30min； 

(2)酸胁迫：经琥珀酸调整后pH值为3.5，在真空下处理20min； 

(3)碱胁迫：经Tris调整后pH值为8.0,在真空下处理20min； 

(4)H₂O₂胁迫(氧化胁迫)：加入H₂O₂使其终浓度为0.4mM,在真空下处理45min； 

(5)盐胁迫：加入NaCl使其终浓度为1.2M,在真空下处理45min； 

(6)渗透胁迫：加入山梨醇使其终浓度为1.7M,在真空下处理45min； 

(7)对照：不经过任何逆境处理； 

(1.2)逆境处理热激因子HSF1： 

(1.2.1)HSF1的非变性表达纯化； 

(1.2.2)HSF1的体外逆境处理； 

(1)热胁迫：取140μl纯化后的HSF1重组蛋白，39℃处理30min； 

(2)酸胁迫：琥珀酸0.05M，pH为6.5，处理20min； 

(3)碱胁迫：Tris浓度为0.33M，pH为8.8，处理20min； 

(4)H₂O₂胁迫(氧化胁迫)：过氧化氢浓度为0.4mM,处理45min； 

(5)盐胁迫：NaCl浓度为1M，处理1h； 

(6)渗透胁迫：山梨糖醇浓度为1M，处理1h； 

(7)对照：不经过任何逆境处理。 

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗和纯化的蛋白的具体步骤包括： 

(1)DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗； 

将上述各种逆境处理和未处理的小苗，在室温下浸入交联缓冲液中,加入50mMDTT在真空下处理1h； 

(2)DTT处理逆境胁迫后纯化的蛋白； 

取140ul蛋白质分别用热﹑酸﹑碱﹑H₂O₂逆境处理后，用DTT处理；将DTT加入至终浓度为5mM，25℃条件下放置30min。