[发明专利]一种集样PCR检测HBV的试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种集样PCR检测HBV的试剂盒及应用。

背景技术

乙型肝炎(HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种以肝脏损伤为主要特征的严重危害人类和动物健康的传染病之一。HBV属于嗜肝病毒科成员，迄今为止，发现的嗜肝DNA病毒科有感染哺乳动物的正嗜肝病毒，可感染人和猩猩等哺乳动物，在黑猩猩、长臂猿、地松鼠和树鼩等动物中均有发现；而另一类感染禽类和鸟类的禽是肝病毒属在北京鸭、雪雁和苍鹭等也均有发现。值得注意的是，近年来，有研究报道在鹦鹉、蝙蝠以及屠宰猪和鸡中也陆续发现了类HBV的存在。新的动物种属中HBV的发现表明HBV病毒可能出现变异或重组、宿主范围正日益扩大，对人类的健康具有威胁性。因此，对HBV在动物中的流行情况进行调查具有十分重要的意义。

目前已有酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测试剂盒投入市场，可用于血清学流行病学调查。但对病毒的检测，目前只能采用常规的PCR法进行检测。现有的PCR检测法虽然具有灵敏、快速、准确的优点，但在进行大量样品检测时，存在样品处理费时、费力，操作繁杂，且浪费试剂等缺陷，尤其是对于那些阳性率比较低的样品筛查，亟待对其进行优化。

目前，HBV流行病学调查主要依赖ELISA试剂盒进行血清学诊断，但此方法仅可在血清学水平对HBV进行调查，不能反映病毒在动物体内的存在情况。同时，在样品量较大时，血清的处理和保存也成为制约ELISA检测准确性和稳定性的因素之一。此外，由于试剂盒本身的批次和厂家不同，其重复性和稳定性也受到影响，商品化的试剂盒在成本方面也不具有优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定多个待测样本中哪些样本感染乙型肝炎病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括单独使用的引物对A、单独使用的引物对B和记载PCR扩增方法的载体；

或包括含有所述引物对A的PCR试剂、含有所述引物对B的PCR试剂和所述记载PCR扩增方法的载体；

所述引物对A由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成；

所述引物对B由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA组成；

所述PCR扩增方法包括如下步骤：

1)将多个待测样本分为n组，且将每组中各待测样本等质量混合得到混合样本，每组待测样本数相同，提取每组所述混合样本的基因组DNA；

2)以每组所述混合样本的基因组DNA为模板，用所述引物对A进行第一次PCR扩增，得到第一次PCR扩增产物；

3)以所述第一次PCR扩增产物为模板，用所述引物对B进行第二次PCR扩增，得到每组待测样本的第二次PCR扩增产物；检测每组待测样本的第二次PCR扩增产物，选取PCR扩增产物具有大小为281bp片段的待测样本组；检测每组待测样本的第二次PCR扩增产物的方法为电泳检测；

4)将所述PCR扩增产物具有大小为281bp片段的待测样本组中的每个待测样本分别提取基因组DNA，分别重复步骤2)和3)，得到每个待测样本的第二次PCR扩增产物；

检测每个待测样本的第二次PCR扩增产物，若第二次PCR扩增产物具有大小为281bp片段，则该待测样本感染或候选感染HBV病毒；若第二次PCR扩增产物不具有大小为281bp片段，则该待测样本未感染或候选未感染HBV病毒。

上述试剂盒中，所述载体为说明书。上述方法中，检测每个待测样本的第二次PCR扩增产物的方法为电泳检测或测序检测；

上述试剂盒中，所述含有所述引物对A的PCR试剂由PCR扩增缓冲液、所述引物对A和水组成；

所述含有所述引物对B的PCR试剂由PCR扩增缓冲液、所述引物对B和水组成。

上述试剂盒中，所述引物对A和所述引物对B中的各条引物均为等摩尔混合；

所述引物对A和所述引物对B中的各条引物在其所在所述PCR试剂中的浓度均具体为0.4μM。

上述的试剂盒或由所述引物对A和所述引物对B组成的引物组或由所述含有所述引物对A的PCR试剂和所述含有所述引物对B的PCR试剂组成的PCR试剂组在制备鉴定或辅助鉴定多个待测样本中哪些样本感染乙型肝炎病毒的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述样本为离体动物组织或血清或胆汁；所述组织具体为肝脏。