[发明专利]一种用于检测ALK融合基因的荧光定量PCR方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种采用荧光定量PCR检测融合基因的方法，特别涉及一种用于检测间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic Lymphoma Kinase，ALK)融合基因的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，可在突变含量只有0.1％的临床样本中检测出低至10个拷贝的融合基因突变分子。

背景技术

肺癌是世界范围内发病率和死亡率均最高的恶性肿瘤。分子靶向药物作为治疗肺癌的新的有效手段，在临床得到越来越广泛的应用。特异性抑制间变性淋巴瘤激酶(ALK)的靶向药物克唑替尼(crizotinib)对由于ALK基因融合而导致ALK激酶活性过高的非小细胞肺癌病人具有很好的疗效，已于2011年获美国食品与药品监管局(FDA)批准上市。此外，数个类似的针对ALK的靶向药物亦已进入临床研究。克唑替尼等靶向药物的使用前提是病人的肿瘤细胞必须高表达ALK激酶；而ALK基因融合是导致ALK激酶高表达的最主要原因。因此，准确地检测肿瘤组织中ALK基因融合对临床筛选出可受益于克唑替尼等靶向药物的肺癌患者具有指导作用。目前临床主要开展的ALK基因融合的方法包括荧光原位杂交和免疫组织化学方法。这两种方法存在操作复杂、主观性强、耗时长、费用高等缺点，因而难以在临床普遍使用。临床上迫切需要一种简便、快速、准确、经济的ALK基因融合检测方法，用以指导肺癌的个性化治疗。

ALK基因与其他基因发生融合突变可导致ALK激酶片段大量表达并自发性激活[1]。其中，EML4-ALK融合基因为迄今所发现的在非小细胞肺癌中发生率最高的ALK融合类型。EML4-ALK基因融合是由于人类第二号染色体短臂发生倒置(inversion)，导致棘皮动物微管相关蛋白样4基因(EML4)与ALK非正常连接所致[2]。此外，研究还发现ALK可与KIF5B、NPM等基因发生融合[4，5]。这些融合基因的蛋白质产物由于融合伴侣(如EML4，NPM等)的特性而形成二聚体，进而引发ALK激酶片段的不依赖于配体的自发性激活。活化的ALK激酶通过激活下游的细胞生长调控相关信号通路如P13K/AKT和MAPK等，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡，从而引起细胞的瘤变[2]。动物实验已经证实EML4-ALK基因融合突变可导致小鼠肺癌的发生[3]。

准确、方便地检测肺癌细胞中的ALK融合情况是明确筛选适合于克唑替尼等靶向药物治疗的病人的基础。但是，目前对于ALK融合基因的检测方法尚缺乏一个明确的标准。荧光原位杂交方法(fluorescent in situ hybridization，FISH)是基础和临床研究中检测基因融合的常用方法。FISH的原理是基于两种不同荧光标记的探针(绿色和红色)分别结合在ALK基因5’端两个相邻的区域，在正常细胞中这两种荧光紧密相连；当ALK基因发生断裂时，这两种荧光产生分离[6]。FISH方法具有直观的优点，但存在荧光探针不稳定、技术要求高、操作复杂、耗时长、费用高等缺点。临床上使用的另外一种检测方法是免疫组织化学方法。免疫组化方法检测的是ALK蛋白质分子的表达水平。其最大的优点是能在检测ALK的蛋白表达水平的同时，观察肿瘤组织的细胞形态和病理特征[7]。但是，由于ALK在肺癌细胞中的表达水平往往较低，免疫组化方法会造成假阴性结果；此外，免疫组化往往难以对ALK的水平进行准确的定量，结果判读较主观，而且耗时较长、抗体不稳定[7]。

最近，Soda等用多重RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组织的EML4-ALK和KIF5B-ALK基因融合，发现该方法与FISH和改良免疫组化方法具有相同的灵敏度和特异性，但却更为方便[4]。RT-PCR方法是先将RNA逆转录成cDNA，再利用分别来自融合基因两个部分的特定DNA序列作为引物对cDNA进行扩增，然后对PCR产物进行测序。但是，该技术存在明显的缺陷：(1)只能检测出已知的突变，不能用于检测新的融合突变，因此会导致假阴性；(2)同时检测多种融合类型需要标本量人，技术复杂；(3)扩增后的后续测序步骤易发生扩增物的扩散而污染操作环境，导致假阳性。

由于针对ALK激酶的靶向药物如克唑替尼等所作用的是因过度表达而导致过高活性的ALK激酶，而不是基因的融合形式，本发明采用一种全新的设计，着眼于对ALK激酶的表达水平变化的检测，而不受限于ALK融合突变的形式和种类。该方法将有效地检测因融合所导致的ALK基因的表达水平的增高，将避免FISH、免疫组化或RT-PCR方法的缺点。

发明内容