[发明专利]一种用于检测ALK融合基因的荧光定量PCR方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测ALK基因融合突变的方法，该方法的特征在于：不受限于融合基因类型而可直接检测ALK融合状态及表达水平。

2.如权利要求1所述，人类ALK基因(NM_004304)第20号至29号外显子包含蛋白激酶区域，本发明针对对临床具有最根本意义的蛋白激酶区域，在第20号-29号外显子上选择数个特定序列，设计用于实时荧光PCR系统的特异性引物和荧光标记分子探针，检测ALK基因的总体表达水平(非融合表达+融合表达，T)；同时，在第1号-19号外显子上选择数个特定序列，设计用于实时荧光PCR系统的特异性引物和荧光标记分子探针，检测ALK基因的基本表达水平(非融合表达，B)；如果T值与B值的比例(T/B ratio)等于或大于2，则表明ALK基因存在因融合突变导致的激酶区域过表达；如果T值与B值的比例(T/B ratio)小于2，则表明ALK基因不存在因融合突变导致的激酶区域过表达。

3.如权利要求1所述，在激酶区以第20号至29号外显子为模板设计的引物和探针，特别是以20～26号外显子为模板设计的引物和探针，其中最适宜的模板区域为20～23号外显子；在非激酶区以第1号至19号外显子为模板设计的引物和探针，特别是以11～19号外显子为模板设计的引物和探针，其中最适宜的模板区域为11～14号外显子。

4.用于检测ALK基因融合突变的特异性引物和探针，包括8组24条引物和探针，见本发明说明书表1(A-SEQ-1～A-SEQ-24)。

5.一种检测ALK基因融合突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1、2所述的方法和权利要求4所述的8组24条引物和探针。

6.如权利要求4所述的检测ALK基因融合的检测试剂盒，包括以下荧光定量PCR反应体系：

7.如权利要求4所述的检测ALK基因融合突变的检测试剂盒，荧光定量PCR反应条件为：

95℃预变性10min后进入以下循环：95℃15sec，61℃1min，进行45个循环，荧光信号收集温度设定在61℃退火温度处。

8.如权利要求4所述的检测ALK基因融合突变的检测试剂盒，待检测样品包括新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织、石蜡切片和血液。

9.一种用于检测ALK基因融合突变的引物和探针，其特征在于，由A-SEQ-1～A-SEQ-24的寡核苷酸引物和探针或序列与其有至少70％同一性的寡核苷酸组成。