[发明专利]一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒，可同时筛查13种蛙病毒属病毒，属于检验检疫领域。

背景技术

近年来，由虹彩病毒科蛙病毒属引起的鱼类、两栖类和爬行类的疾病遍布全球，涉及许多组织系统性感染疾病，出现病症后的宿主动物死亡率高达100％，给水产业造成了非常大的经济损失。在亚洲、大洋洲、欧洲、北美洲和南美洲等地区从自然生存、养殖、健康以及死亡的蛙中均分离到了蛙病毒属病毒，蛙病毒属已被世界动物卫生组织(OIE)规定为必须申报的水生动物疫病之一。

蛙病毒属属于虹彩病毒科，为裸露或有囊膜的二十面体病毒粒子，病毒直径约150～170nm，基因组是单一线状双链DNA，全长为150～170kb，GC含量为49％～55％，在细胞核和细胞质中都能复制。其结构蛋白主衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)占整个病毒粒子多肽的40～45％，具有高度的保守性，又具有足够的变异性，氨基酸同源性达65.9％，是虹彩病毒进化和分类的重要依据，所以本发明利用MCP的同源性差异进行蛙病毒属病毒的鉴别和区分，该方法是可靠的。

由于蛙病毒属病毒的基因序列相似性达90％以上，所以设计特异的引物和探针对于区分和鉴别蛙病毒属病毒非常关键。目前，研究者们建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR的检测方法、虎纹蛙病毒(tiger frog virus，TFV)的普通PCR方法、大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass virus，LMBV)的双重PCR检测方法以及大鲵虹彩病毒ADIV(Andrias davidiamus iridovirus)TaqMan实时荧光定量PCR的检测方法，上述方法，对于同一个检测样本，最多能鉴别和区分2种蛙病毒属病毒，而本发明第一次建立了蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR方法，对于同一个检测样本，可同时鉴别和区分13种蛙病毒属病毒，降低了检测成本，节省了检测时间，实现了高通量处理样本的简便性，该方法具有快速性、准确性和高灵敏性的特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、快速、灵敏、特异和高效的鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒。该方法检测覆盖蛙病毒属病毒种类多，是一种特异性强，准确性高、灵敏性高的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一组鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物和探针，其中，采用一对通用引物，正向引物为5′-ATGGTGCARAACGTCA-3′(SEQ ID NO：1)，反向引物为5′-GCTCCAKSACSGTGTT-3′(SEQ ID NO：2)。

所述探针如下所示：

探针1：5′-CTTCCGTCGGCTCCAATTACACC-3′(SEQ ID NO：3)

探针2：5′-CCAACAACAGGAGTGACGCAAGTG-3′(SEQ ID NO：4)

探针3：5′-CTGTGGGTTCAAATTATACGTGTGT-3′(SEQ ID NO：5)

其中，所述序列SEQ ID NO：3为鉴别沼泽绿牛蛙虹彩病毒RGV(Rana grylio virus)、中华鳖虹彩病毒STIV(Soft-shelled Turtle iridovirus)、虹彩病毒3型FV3(frog virus3)、饰纹汀蟾(穴居蛙)虹彩病毒BIV(Limnodynastes ornatus or bohel iridovirus)、虎纹蛙病毒TFV(tiger frog virus)、大鲵虹彩病毒ADIV(Andrias davidiamus iridovirus)、流行性造血器官坏死症病毒EHNV(Epizootie hematopoietie necrosis virus)、欧洲鮰鱼病毒ECV(European catfish iridovirus)和欧鲶病毒ESV(European sheetfish iridovirus)的探针，并且5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1淬灭基团。

所述序列SEQ ID NO：4为鉴别大口黑鲈病毒LMBV(Largemouth bass virus)、裂唇鱼病毒DFV(doctor fish virus)和孔雀鱼病毒6型GV6(guppy virus6)的探针，并且5′端标记HEX荧光报告基团，3′端标记BHQ1淬灭基团；LMBV、DFV和GV6统称为SCRV(Santee-Cooper ranavirus)。