[发明专利]一种筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法，为miRNAs的功能研究中寻找其调控的可能靶基因提供了一种简单、实用的方法。

背景技术

miRNAs是一类由大约19-23个碱基组成的单链RNA分子，是一种不能编码蛋白质但是具有重要调控作用的小RNA。成熟的miRNA通过碱基互补配对可以结合到靶基因的相关序列上面，现在已知报道的结合位点可以位于基因mRNA的3’和5’非翻译区，也可能位于基因的启动子区域。现在已知miRNAs在包括细胞分化、凋亡、增殖、发育、造血和肿瘤等多种生命活动中具有重要的调控功能。由于miRNA发挥调控生命活动的作用是通过与调控靶基因的表达实现的，所以对于miRNAs靶基因的寻找和确定对于miRNAs的功能研究具有重要的意义。但是由于miRNAs和靶基因之间的互补结合可以通过碱基的不完全匹配，因此一个miRNA可能会调控很多种的靶基因，所以导致miRNAs的寻找十分困难。现在对于miRNAs靶基因的寻找主要是通过生物软件的预测，但是生物软件预测具有不真实性、假阳性率较高、工作量太大等缺陷，所以使用实验方法直接分离和筛选出miRNAs调控的靶基因具有了十分重要的价值。基因的启动子等基因组区域由于存在很多的甲基化等修饰，使得基因组区域DNA的折叠和裸露程度都很复杂，对于miRNAs与这些区域的结合更加难以预测，因此建立一种在正常生理状态下直接筛选和鉴定出miRNAs调控的基因组DNA对于miRNAs的功能研究具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以直接且准确筛选和鉴定miRNAs所调控的基因的方法。

本发明的技术方案如下：

（1）将miRNAs与靶基因组DNA互补结合的RNA链进行生物素标记，转染细胞后，利用甲醛将miRNAs和与之结合的DNA、蛋白交联在一起；

（2）通过生物素（biotin）和链霉亲和素（streptavidin）之间的强亲和力作用，将生物素标记的miRNAs以及结合在一起的DNA进行亲和沉淀分离和纯化；

（3）通过克隆和测序鉴定分离纯化出来的DNA序列，利用生物信息学分析DNA序列所在基因的名称，鉴定出miRNAs调控的靶基因。

本发明可以筛选和鉴定出miRNAs调控的任意一个基因组DNA序列和相应的基因名。同时，通过本发明建立的方法可以应用到所有靶向基因组DNA的miRNAs的功能研究。

已经通过实验证明该方法能够有效的将miRNA-373调控的上皮钙粘蛋白（epithelia cadherin，E-cadherin）和冷休克结构域蛋白C2（Cold shock domain-containing protein C2，CSDC2）的启动子区域DNA进行了分离和纯化，同时将分离纯化到的DNA通过克隆和测序获得DNA序列，利用生物信息学分析获得了DNA序列所在的基因名称，并通过分子生物学实验证实了miRNA-373能够促进这些基因的转录水平升高，证实了miRNA-373能够调控这些基因的表达。因此本发明成功构建了一种筛选和鉴定出miRNA调控的基因组DNA的实验方法。该方法的建立将对miRNA的功能研究具有重要的意义，同时因为已经证实miRNAs在癌症和肿瘤等疾病的发生中具有重要的调控作用，所以该方法的建立也有助于寻找与肿瘤等疾病发生、发展相关的肿瘤基因，为肿瘤等疾病的治疗和药物开发提供靶位点，对于肿瘤等疾病的治疗相关药物的研发具有重要的应用价值和前景。

附图说明

图1：生物素标记的miRNA-373通过启动子调控E-cadherin的表达。

图2：Streptavidin-Biotin亲和沉淀流程图。

图3：miR-373靶基因E-cadherin和CSDC2的启动子能够被沉淀。

图4：DNA克隆测序流程图。

图5：miR-373调控未知靶基因的表达。

具体实施方式

实施例1 miRNA进行生物标记和转染

将miRNA-373的反义链3’末端进行生物素标记，使用转染试剂Lipofectamine 2000转染进细胞中，24小时后使用Trizol对细胞总RNA进行提取。反转录成cDNA后利用实时定量PCR方法检测miRNA-373对靶基因E-cadherin的表达调控作用，使用扩增引物为：

E-cadherinRTF：5’-CCTGGGACTCCACCTACAGA-3’，