[发明专利]一种乙酸乙酯的合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及有机化学和生物技术领域，特别涉及一种利用基因工程技术催化合成乙酸乙酯（EA）的方法。

背景技术

乙酸乙酯（EA）是一类重要的有机溶剂和有机化工基本原料，广泛应用于有机合成、医药、香料、食品等行业，近年随着锂电行业的兴起，EA的用量逐渐增大，预计未来几年国内市场对乙酸乙酯的需求量将保持在10%左右的增长率^[1]。

从生产工艺来看，在国内外市场中，采用乙酸酯化法制备乙酸乙酯的生产能力约占总生产能力的67.5%，我国制备乙酸乙酯主要采取乙酸酯化法；传统的乙酸酯化法多以硫酸为催化剂，但硫酸对设备腐蚀严重，其强氧化性易引发副反应，产品分离提纯工序多，难度大，温度高，耗能高；因此，近些年有许多努力尝试从不同的方向来克服这些缺陷^[2]；如葛清秀等^[3]研究采用碱性脂肪酶来催化合成乙酸乙酯，该研究虽避免了使用强酸为催化剂，在36℃的温度下即可合成乙酸乙酯，但所用酶难以重复使用，反应时间较长需48小时，产率低于80%，且所用正庚烷沸点为98.5℃，在与乙酸乙酯分离时还需较高温度，耗能较大。

而展示酶的酵母菌细胞具有固定化酶可重复使用的优点，又具有制备简单，可高密度培养获得大量菌体，成本较低的特点，因而自上世纪末问世以来，发展迅猛，已有许多种蛋白或酶被成功表达的报道，该技术关键在于能否构建展示在酵母表面具所需活性蛋白或多肽且能扩增生产的基因工程菌，目前除本发明人外尚未见酵母展示稻米脂肪酶及其应用的报道，未见酵母展示脂肪酶特别是稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的研究报道。

参考文献：

[1]王超，候涛.一种乙酸乙酯脱水除杂方法：中国，201010598729.5[P].2010-12-21

[2]韦毅，黄科林，王桂英，彭小玉.乙酸乙酯合成的研究进展[J].大众科技，2013,15（6）：104-106.

[3]葛清秀，陈建平，黄祖新，柳荣金，孙斌.碱性脂肪酶在正庚烷中催化合成乙酸乙酯的研究[J].食品工业科技，2006，（2）：156-158。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是乙酸乙酯传统酯化工艺中强酸催化剂对设备腐蚀严重、高温分馏产物能耗高，而普通脂肪酶催化合成乙酸乙酯时间长、产率低、难重复利用的问题。

本发明采取的技术方案是：将序列为SEQ NO1的稻米脂肪酶基因展示在毕赤酵母表面构建具有酶活力的基因工程菌，通过该基因工程菌的扩增培养使稻米脂肪酶产量大幅增加，将该展示了稻米脂肪酶的基因工程菌加入乙酸、乙醇、沸点在45~60℃的有机溶剂混合体系中，于30~45℃进行催化合成反应，期间间歇静置分层或用除水剂除去下层的水液，上层经45~60℃加热回收有机溶剂，即得乙酸乙酯。

具体而言，以重量计在100份乙酸与乙醇混合体系（W/W=1.7~1.4）中，加入50~100份的沸点在45~60℃之间如丙酮或正己烷类有机溶剂、2~6份表面展示有稻米脂肪酶的酵母菌菌体（湿重），于30~45℃进行催化合成反应1~8 h后，定时静置分层或用2~10份重3A分子筛除去下层的水液，于45~60℃回收有机溶剂后得到乙酸乙酯。

本发明与现有技术相比，反应时间短，转化率高，1~6 h乙酸乙酯转化率即可达93%以上，反应后分离所得基因工程菌通过冲洗过滤后可重复用来催化合成反应，重复使用6次后，其单位时间内乙酸转化成乙酸乙酯转化率[=（反应前NaOH滴定算出的乙酸mol数-反应后NaOH滴定算出的乙酸mol数）/反应时间]仍可达83%以上，因而绿色、节能、环保，大幅降低了生产成本。

 

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1 、毕赤酵母展示稻米脂肪酶

1、Rlipase基因合成委托生物公司（本例由南京金斯瑞生物科技有限公司）完成，基因克隆在pUC57载体上（pUC57-Rlipase），DNA序列如SEQ1所示。

2、  Rlipase亚克隆到pPIC9K载体中

分别将pUC57-Rlipase和pPIC9K载体进行Eco RI和Not I双酶切， 酶切反应体系分别如下：

pUC57-Rlipase质粒                 34 ml

10* buffer                                4 ml