[发明专利]纯天然脑蛋白水解物原料制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纯天然脑蛋白水解物原料制备方法。

背景技术

纯天然脑蛋白水解物是用猪脑提取的，无蛋白质，含有多种人体必需氨基酸、非必需氨基酸、多肽等，具有广阔的药用前景。上世纪70年代，脑蛋白水解物最早由奥地利EBEWE药厂以Cerebrolysin（施普善）为商品名出售，用于治疗小儿发育不全、老年痴呆、脑血管病后遗症等多种疾病及辅助治疗，并取得良好的效果，得到临床医生的肯定。但当时所有文献数据中均未披露该制剂的制备方法。1995年,国家卫生部批准生产脑蛋白水解物注射液。但是，国内制备得到的脑蛋白水解物氮含量偏低，达不到国家规定标准，只能通过“补加”外源氨基酸以达到规定标准，其制备方法大致相同，即脱脂、双酶解、超滤、层析、加氨基酸。而外源性“补加”氨基酸都是属于生物发酵氨基酸和部分石油副产品合成氨基酸，与动物蛋白质的水解氨基酸有很大区别。因此，2008年12月15日，国家药监办【2008】734号文件要求脑蛋白水解物不得补加外源性氨基酸。2012年7月20日国家药典委员会发布《关于脑蛋白水解物系列品种质量标准修订稿征求意见的通知》（国药典化发2012[2012]400号），所附标准明确规定了脑蛋白水解物系列品种生产过程中不得添加非水解产物如各种氨基酸，并附脑蛋白水解物溶液质量标准。但是，如果不 “补加”氨基酸，则均不能生产出合格的产品，主要是指纹图谱相似度均不能达到90%的标准，而且注射液产品在储存过程中有絮状物和酪氨酸沉淀物等致澄清度不合格。

因此，寻找一种既不需要外源性“补加”氨基酸又能制备出符合国家标准的纯天然脑蛋白水解物原料的制备方法成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是提供一种既不需要外源性补加氨基酸又能制备出符合国家标准的纯天然脑蛋白水解物原料的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供的方法包括如下步骤：

a.纯化蛋白，取冻存新鲜猪脑，解冻，清洗，匀浆，将浆液加入浓盐酸搅匀、然后离心分离，去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得沉淀脑蛋白；

b.胃蛋白酶酶解，将经上述步骤得到的沉淀蛋白加水匀浆，然后加入胃蛋白酶搅拌，再加入浓盐酸搅拌，然后离心分离，收集上清液，即得胃酶酶解液；

c.酸水解，将经上述步骤所得胃酶酶解液加入硫酸进行水解，得酸水解液；

d.胰蛋白酶酶解，将经上述步骤所得酸水解液调pH值至7-9，加入猪脑重量0.1-0.4%的胰酶进行水解，再离心分离，即得胰酶酶解液；

e.层析，将经上述步骤所得胰酶酶解液调pH值为6.5-7.5，再用氨水解析，即得层析液；

f.浓缩，将经上述步骤所得层析液真空浓缩，调pH值至6.5-7.5，然后冻结保存；

g.去杂质，将经上述步骤所得浓缩冰冻液解冻，然后离心分离，收集上清液，将上清液超滤，即得天然脑蛋白水解物原料。

作为进一步改进，所述纯化蛋白步骤，取冻存新鲜猪脑，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入猪脑重2-4倍重量的纯化水用胶体磨匀浆15min，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至70-100℃后保温10-30min，再按猪脑重每1kg加入2-5 ml的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至10-50℃，再以3000-4000r/min的速度离心分离，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得沉淀脑蛋白。

作为进一步改进，所述胃蛋白酶酶解步骤，将经纯化蛋白步骤得到的沉淀蛋白按猪脑与水的重量比1:1-3的比例加纯化水，匀浆15min，倒入提取罐中，加热升温至30-50℃，然后加入猪脑重1-2%的胃蛋白酶搅拌10-15min，再按猪脑重每1kg加7-9 ml的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅拌1-4小时后静置保温1-3小时，然后以3000-4500r/min的速度离心分离，收集上清液，即得胃酶酶解液。

作为进一步改进，所述酸水解步骤，将经胃蛋白酶酶解步骤所得胃酶酶解液加入浓度为18.4mol/L的浓硫酸进行水解，酶解液与浓硫酸的体积比为1:62.5-750，加热至80-121℃，水解3-6h，然后冷却至30-40℃，即得酸水解液。