[发明专利]肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产细菌多糖菌株，及利用该菌株发酵生产多糖的方法和多糖的应用，它属于生物工程技术领域。

背景技术

多糖在自然界分布很广，在高等植物、动物、微生物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生物聚合物之一。多糖具有多方面的功能，如能量储存、结构支持、防御功能等。早在上世纪40年代，多糖就开始用作药物，1951年美国人Reihy H首次发现微生物担子菌中的多糖有抑制肿瘤的活性，到了60年代，多糖作为广泛的免疫促进剂引起人们的极大兴趣，开发多糖为保健食品与药物也倍受关注。已有研究证明饲料中添加活性多糖能显著提高动物免疫功能，改善动物生长和生产性能，降低动物死亡率。

很多多糖具有免疫增强活性，表现出对宿主免疫的介导和调节作用，通过刺激免疫细胞的成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其他生理因子的反应性。以此为基础，多糖表现出与免疫力相关的多种活性功能，如抗肿瘤、降血糖、抗衰老、促进肝脏和骨髓细胞的蛋白质和核酸的合成、抗炎及抗辐射作用等。

近年来，我们通过分离、筛选和纯化，从肉灵芝中分离得到了一株高产胞外多糖的细菌菌株阴沟肠杆菌Z0206。所谓肉灵芝，在民间被称之为“太岁”，据《本草纲目》记载，肉灵芝为本草上品，它是在我国发现的一种天然珍稀物种，即被我国科学界早已认定的一种原生质生命体，确切定名应为“特大型粘菌复合体”。研究表明，菌株阴沟肠杆菌Z0206具有高产多糖的特性，这种细菌多糖以分泌的形式到达胞外，具有产量高、安全、无毒副作用等优点。阴沟肠杆菌Z0206细菌多糖具有一定的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等活性。因此，阴沟肠杆菌Z0206细菌多糖制备在抗氧化和抗肿瘤药物及添加剂开发和应用上具有重要的意义和广阔的前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种肠杆菌Z0206多糖的制备方法，(1)斜面种子培养：取保藏号为CGMCC No.2279的肠杆菌Z0206；种肠杆菌Z0206多糖的制备方法：接种到灭菌PDA加富固体培养基上，28-32℃培养36-48h，再次转接到PDA加富固体培养基上，28-32℃培养36-48h，得到活化菌种；(2)发酵罐培养：将步骤(1)所得到的活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，温度28-32℃摇床振荡培养18-20h，得到发酵种子液；发酵罐内加入70％发酵培养基，121℃蒸汽灭菌20min，接种发酵种子液，发酵时间48-72h，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；(3)将步骤(2)所得的发酵液于60-70℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/10，加入3-5倍体积预冷的95％乙醇，分离取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，真空干燥，得到粗多糖粉末；(4)将步骤(3)所得的粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，用Na₂CO₃调pH至7.0-9.0，加入质量为多糖质量1/40-1/20的胰蛋白酶，55℃水解1-2h后，用草酸调pH至5.0-5.7，加质量为多糖质量1/40-1/20的木瓜蛋白酶，65-70℃水解2-3h后，于100℃水浴加热5-6min，以终止酶反应；(5)将步骤(4)所得的蛋白酶处理液用草酸调pH值至7.0，加入3％的三氯乙酸，室温下180-200r/min搅拌1h后，11000rpm离心10-15min，取上清；(6)向步骤(5)所得的清液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡脱去蛋白，制得多糖溶液；(7)将步骤(6)所得的多糖溶液用氨水调pH至8.0，在50℃下滴加20％的H₂O₂，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和PH值至7.0；自来水透析1-2d，蒸馏水透析2-3d后，经真空冷冻干燥得多糖精品。