[发明专利]肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及应用

权利要求书

1.一种肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征是:

(1)斜面种子培养：取保藏号为CGMCC No.2279的肠杆菌Z0206；种肠杆菌Z0206多糖的制备方法：接种到灭菌PDA加富固体培养基上，28-32℃培养36-48h，再次转接到PDA加富固体培养基上，28-32℃培养36-48h，得到活化菌种；

(2)发酵罐培养：将步骤(1)所得到的活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，温度28-32℃摇床振荡培养18-20h，得到发酵种子液；发酵罐内加入70％发酵培养基，121℃蒸汽灭菌20min，接种发酵种子液，发酵时间48-72h，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；

(3)将步骤(2)所得的发酵液于60-70℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/10，加入3-5倍体积预冷的95％乙醇，分离取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，真空干燥，得到粗多糖粉末；

(4)将步骤(3)所得的粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，用Na₂CO₃调pH至7.0-9.0，加入质量为多糖质量1/40-1/20的胰蛋白酶，55℃水解1-2h后，用草酸调pH至5.0-5.7，加质量为多糖质量1/40-1/20的木瓜蛋白酶，65-70℃水解2-3h后，于100℃水浴加热5-6min，以终止酶反应；

(5)将步骤(4)所得的蛋白酶处理液用草酸调pH值至7.0，加入3％的三氯乙酸，室温下180-200r/min搅拌1h后，11000rpm离心10-15min，取上清；

(6)向步骤(5)所得的清液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡脱去蛋白，制得多糖溶液；

(7)将步骤(6)所得的多糖溶液用氨水调pH至8.0，在50℃下滴加20％的H₂O₂，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和PH值至7.0；自来水透析1-2d，蒸馏水透析2-3d后，经真空冷冻干燥得多糖精品。

2.根据权利要求1所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中，PDA加富固体培养基的配方如下：马铃薯20％，蛋白胨0.2-0.5％，酵母浸膏0.3％，葡萄糖2％，琼脂粉1.6％；PDA加富液体培养基配方如下：马铃薯20％，蛋白胨0.2-0.5g％，酵母浸膏0.3％，葡萄糖2％；发酵培养基的配方如下：玉米淀粉20％，豆粕粉1.6％，玉米浆干粉0.6％，K₂HPO₄.3H₂O0.3％,KH₂PO₄0.3％，CaCl₂0.1％。

3.根据权利要求2所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，摇瓶发酵条件为：接种量3环，往复振荡冲程4-10cm，振荡频率200-250rpm。

4.根据权利要求2或3所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，发酵罐发酵条件为：接种量4％，pH为7.5，温度32℃，通气量为0.25-0.75vvm，机械搅拌转速200-300rpm。

5.根据权利要求4所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中的Sevag试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为4：1。

6.如权利要求1～5任一所述方法制备而得的肠杆菌Z0206细菌多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健品或添加剂中的应用。