[发明专利]一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法

说明书

技术领域

本发明属于寄生虫电镜样品制备技术领域，特别涉及一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法。

背景技术

寄生虫为一大群体，寄生于宿主的细胞、组织或腔道内，引起一系列的损伤，并引发各种的疾病，寄生虫可因寄生环境的影响而发生形态构造变化，因此形态学观察是研究寄生虫的基础和热点。早期，应用光学显微镜等传统形态学方法鉴定寄生虫，随着科技的进步和发展，扫描电子显微镜观察已成为研究寄生虫的形态结构是较为先进和常用的手段，对各部位的细微结构具有很高的辨别清晰度，比用光学显微镜进行虫种鉴定更加准确可靠。1988年沈阳农业大学学报刊登的“寄生虫扫描电镜观察样品简易制备法”,提供了一种寄生虫扫描电镜观察样品简易制备法，该方法应用在寄生虫扫描电镜中存在的不足有：1）70%乙醇固定，固定效果差，且样品采集固定后储存时间短，不能较长时间保存；2）没有用滤纸包裹，容易损失；3）直接70%固定脱水，没有梯度缓慢脱水，寄生虫易失水太快变形；4）100 % 乙醇中只有10分钟，不能保障充分脱水，影响后期置换；5）CO₂做临界点干燥，设备、醋酸异戊脂纯度要求高，干燥过程中寄生虫表面还是会产生不同程度的损伤褶皱，效果不是特别完美，易轻微变形，且成功率不高；6）真空镀铝膜，导电性一般。由于寄生虫较多是软体生物，形态较小，样品制备过程中容易变形和丢失。为了适应寄生虫扫描电镜的要求，更好的显露表面形态结构，在制样过程中必须进行特殊处理，才能制备保持高度完整性和良好形态结构特征的寄生虫扫描电镜观察样品。目前这种处理的方法还不够完善，因此需要进一步研究。

 

发明内容

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，为此我们探索了一种用环氧树脂包埋法制备寄生虫样品的方法，利用此方法我们制备过大量的寄生虫样品，结果证明此方法制备寄生虫不易变形，形态逼真，成功率较高，且能较长自然保存。

本发明是通过以下技术手段实现的：

一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，包括以下步骤：

步骤一，样品前期处理：将寄生虫活体迅速杀死后包裹于定性滤纸中； 

步骤二，样品固定：将样品置于戊二醛中固定2～4小时，然后使用PBS缓冲液将样品表面清洗干净，除去戊二醛，再用锇酸固定，将寄生虫熏成黑色；

步骤三，样品清洗和梯度脱水：使用PBS缓冲液将样品表面清洗干净，除去锇酸，然后用体积浓度为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％、100％的丙酮作梯度脱水；

步骤四，置换：寄生虫脱水后采用环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸渍包埋；

步骤五，清洗：将环氧树脂包埋剂浸渍后的寄生虫挑出放到网眼小于寄生虫体的筛网上，在70℃条件下聚合3～5小时，自然冷却至室温后用丙酮清洗，直到线虫表面变为无光泽为止，再在70℃条件下聚合12～24小时；

步骤六，样品镀膜：将聚合好的样品台用离子溅射仪喷金90 ~ 120s，在寄生虫样品表面均匀镀上一层导电的金膜，即完成寄生虫扫描电镜样品的制备。

所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，步骤一中活体寄生虫可以在试管中于60℃、 3~5分钟条件下迅速杀死。

所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，步骤二中戊二醛的质量浓度可以为2％。

所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，步骤二中锇酸的质量浓度可以为1％。

所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，步骤四中置换包埋可以为将寄生虫充分脱水后转入体积比为1:3的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸渍2小时，然后转入体积比为1:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸渍4小时，再转入体积比为3:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸渍6小时，最后转入纯环氧树脂包埋剂中浸渍8~12小时。

以上所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，其中所述的寄生虫是：样品相对较小，形态易变，体内无脊椎骨骼支撑的扁形动物门或者原生动物门。

本发明对寄生虫样品固定前处理，原理：1）寄生虫生命力顽强，活体直接在2.5%戊二醛中固定，因应激挣扎蜷缩，对寄生虫形态结构有较大影响，高温迅速杀死寄生虫，将易于保持寄生虫正常形态；2）寄生虫小，用定性滤纸包裹，易于减少因操作流程中样品的丢失。环氧树脂包埋剂浸渍置换包埋原理：环氧树脂包埋剂易于与体内丙酮置换，为透射电镜的常用包埋剂，硬度高，浸透容易。