[发明专利]一种Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及到Panx3基因过表达慢病毒载体的构建，具体涉及一种Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术

Panx3是2000年Panchin等在脊椎动物体内发现一类缝隙连接蛋白，是脊椎动物最主要的缝隙连接蛋白家族之一。它能形成缝隙蛋白通道，允许离子和小分子物质通过，进而使相邻细胞以及细胞与细胞外基质相互连接，是细胞间活动同步化的基础。目前，针对Panx3基因的功能主要表现在形成半通道，传递钙离子、cAMP及ATP等信号分子，进而影响下游一系列细胞增殖、分化等功能。

慢病毒是一种分子生物学中对基因功能研究常见的工具质粒，能高效转染原核以及真核细胞，使细胞能够合成并且表达目的基因，通过对比目的基因在细胞内表达与否或者表达强度，实现对目的基因在细胞甚至机体功能中的作用进行验证和分析。因此，慢病毒在研究基因在细胞及机体功能中的应用极为广泛。由于Panx3基因的功能主要与钙离子、ATP等相关，而目前对于钙离子及ATP的研究方法均涉及绿色荧光的应用，而目前的相关研究设计的载体为非荧光或者绿色荧光标示，或者不能直接进行观察转染效果，或者与细胞内钙离子和ATP变化的研究相干扰。因此如何直观、有效区别慢病毒转染细胞及细胞内钙离子和ATP变化显得极为重要。

发明内容

本发明的目的在于解决Panx3基因研究中过表达载体与功能研究相互干扰问题，提供一种Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体。

本发明的另一目的在于提供上述载体的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体，以慢病毒载体pLL3.7为骨架载体，在pLL3.7的CMV启动子后面按照5’到3’方向插入Panx3基因、CMV启动子和RFP（红色荧光蛋白）基因片段（Panx3-CMV-RFP基因片段）。

优选的，所述的Panx3基因、CMV启动子和RFP基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

上述Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：设计5’端含有限制性内切酶酶切位点的引物，分别扩增Panx3基因、CMV启动子和RFP基因片段，根据所扩增片段5’端的酶切位点和慢病毒载体pLL3.7酶切位点将Panx3基因、CMV启动子和RFP红色荧光蛋白片段连接到pLL3.7上。

优选的，所述的Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：

（1）提取人牙髓细胞的总RNA，以逆转录的cDNA为模板，PCR扩增Panx3基因片段，所用引物为：

引物1：5’-CCCAAGCTTATGTCACTTGCACACACAG-3’，

引物2：5’-CGCAAGCTTTTTGACTCTTCGGCTCCA-3’；

通过HindIII酶切位点将Panx3基因连到pCDNA3.1(+)上得到pCDNA3.1(+)-Panx3重组质粒。

（2）以Thy-Brainbrow-1.0H（Addgene中国代理公司，Plasmid 18724）质粒为模板，PCR扩增RFP红色荧光蛋白片段，所用引物为：

引物3：5’-TCCCCCGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCG-3’，

引物4：5’-CCCTTCGAACTGGCAACTAGAAGGCACAGTCG-3’；

通过SmaI和BstBI酶切位点将RFP基因连到pCDNA3.1(+)-Panx3上得到pCDNA3.1(+)-Panx3-RFP重组质粒。

（3）以pCDNA3.1(+)为模板，PCR扩增CMV启动子片段，所用引物为：

引物5：5’-CGCGGATCCGCTTGACCGACAATTGCAT-3’，

引物6：5’-CGCGGATCCATTTCGATAAGCCAGTAAGCAG-3’；

通过BamHI酶切位点将CMV基因连到pCDNA3.1(+)-Panx3-RFP上得到pCDNA3.1(+)-Panx3-CMV-RFP重组质粒。

（4）通过NheI和PmiI酶切位点将pCDNA3.1(+)-Panx3-CMV-RFP上的Panx3-CMV-RFP片段连到pLL3.7上得到Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体（pLL3.7-CMV- Panx3-CMV-RFP）。