[发明专利]一种Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体，其特征在于：以慢病毒载体pLL3.7为骨架载体，在pLL3.7的CMV启动子后面按照5’到3’方向插入Panx3基因、CMV启动子和RFP基因片段。

2.根据权利要求1所述的Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体，其特征在于：所述的Panx3基因、CMV启动子和RFP基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述的Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：设计5’端含有限制性内切酶酶切位点的引物，分别扩增Panx3基因、CMV启动子和RFP基因片段，根据所扩增片段5’端的酶切位点和慢病毒载体pLL3.7酶切位点将Panx3基因、CMV启动子和RFP红色荧光蛋白片段连接到pLL3.7上。

4.根据权利要求4所述的Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提取人牙髓细胞的总RNA，以逆转录的cDNA为模板，PCR扩增Panx3基因片段，所用引物为：

引物1：5’-CCCAAGCTTATGTCACTTGCACACACAG-3’，

引物2：5’-CGCAAGCTTTTTGACTCTTCGGCTCCA-3’；

通过HindIII酶切位点将Panx3基因连到pCDNA3.1(+)上得到pCDNA3.1(+)-Panx3重组质粒；

（2）以Thy-Brainbrow-1.0H质粒为模板，PCR扩增RFP红色荧光蛋白片段，所用引物为：

引物3：5’-TCCCCCGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCG-3’，

引物4：5’-CCCTTCGAACTGGCAACTAGAAGGCACAGTCG-3’；

通过SmaI和BstBI酶切位点将RFP基因连到pCDNA3.1(+)-Panx3上得到pCDNA3.1(+)-Panx3-RFP重组质粒；

（3）以pCDNA3.1(+)为模板，PCR扩增CMV启动子片段，所用引物为：

引物5：5’-CGCGGATCCGCTTGACCGACAATTGCAT-3’，

引物6：5’-CGCGGATCCATTTCGATAAGCCAGTAAGCAG-3’；

通过BamHI酶切位点将CMV基因连到pCDNA3.1(+)-Panx3-RFP上得到pCDNA3.1(+)-Panx3-CMV-RFP重组质粒；

（4）通过NheI和PmiI酶切位点将pCDNA3.1(+)-Panx3-CMV-RFP上的Panx3-CMV-RFP片段连到pLL3.7上得到Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体。

5.权利要求1或2所述的Panx3基因过表达的红色荧光慢病毒载体在研究Panx3基因功能中的应用。