[发明专利]一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，聚合酶链式反应。

背景技术

FMR1基因位于X染色体的q27.3，序列长度约38kb，由17个外显子和16个内含子组成，编码脆性X智力残疾基因蛋白（FMRP）。FMR1基因是一个高度保守的基因，其5’端外显子上的非翻译区内有一个（CGG）n三核苷酸串联重复序列，（CGG）n片段在重复模式上存在多态性，并且可以遗传，在其上游大约250bp处有一个CpG岛。正常FMR1基因（CGG）n中n的数值介于7至54之间。当n增加到54至200时，携带者表型虽正常，但在传代过程中易发生进一步扩展，这种FMR1基因的突变称为FMR1基因的前突变。前突变的FMR1基因中的CpG岛一般不甲基化，FMR1基因具有正常的转录和蛋白质水平，不表现出临床症状。当n扩展达200以上时，男性表型100%表现为典型的脆性X染色体综合征（Fragile X Syndrome），女性中也有30%-50%表型表现轻重程度不等的智力残疾（Martin-Bell 综合征），这种FMR1基因的突变称全突变。前突变至全突变的扩展是严格母系的遗传，全突变（CGG）n重复序列大量扩展，引起FMR1基因5’端CGG序列重复区一侧的CpG岛异常甲基化，使FMR1基因失，导致FMRP的缺失引起智力残疾。

FMR1基因突变可以导致脆性X染色体综合征，是智力残疾的主要因素之一。脆性X染色体综合征是一种发病率仅次于先天愚型的遗传性智能低下综合征，发病率占全部儿童的0.05%，呈X连锁遗传，占X连锁智能低下的40%。其外显率因性别不同有差异，男性80%，女性30%。95%以上的脆性X染色体综合征患者发病的分子遗传学基础是FMR1基因（CGG）n结构扩展的动态突变引起的，约5%以下则是由于FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMRP的正常结构导致的。脆性X染色体综合征发病率高，临床表现复杂，遗传规律明确，目前无有效的治疗方法，要降低其发病率，关键是查出携带者及病人，然后通过遗传咨询、产前诊断、阻止患儿出生。

目前针对FMR1基因的检测方法主要为RFLP连锁分析、DNA杂交分析、PCR扩增等方法，但是由于FMR1基因CGG序列重复区和CpG岛中高含量的CG使FMR1基因的DNA解链以及引物的延伸都变得非常困难。

鉴于以上的问题，一种可操作性更强的检测方法的发明是一种趋势的。

发明内容

本发明要解决的技术问题主要是：

FMR1基因其5’端外显子上的非翻译区CGG序列重复区和CpG岛中有高含量的CG，这使FMR1基因的DNA解链以及引物延伸变得非常困难，这使得针对FMR1基因的PCR扩增和测序反应的一次成功率很低，失败率高。

已有的报道中所采用的检测方法是采用一种针对高GC含量的PCR扩增方法，但是，针对CG含量如此高的序列在实际操作中并不容易实现，失败的几率非常高，不能开发为针对FMR1基因中CGG序列重复数的稳定检测手段。

为了解决以上问题，本发明技术提供了一种检测FRM1基因CGG序列重复的方法，其包括如下实现步骤：

在FMR1基因CGG序列重复区设定一对内参引物：正向引物F和反向引物M，扩增的片段作大小约为220bp，用于验证PCR反应是可行的和为计算CGG序列重复数提供基准。

所述扩增的内参引物序列为：

SEQ NO.1 F：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’

SEQ NO.2 M：5’-CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3’

在FMR1基因CGG序列重复区下游设定一对引物：正向引物F1和反向引物R，扩增片段大小约为（470+3n）bp（n代表CGG重复数），用于确定CGG序列重复数所在的区域。

所述扩增的反向引物序列为：

SEQ NO.3 F1：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’

SEQ NO.4 R：5’-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3’

所述具体处理步骤如下：

（1）DNA 提取，取200μL DNA样本溶液用试剂盒提取DNA，采用核酸分析仪或分光光度计进行DNA浓度及纯度鉴定；

（2）反应体系的配置，在每一个反应孔中加入一定的反应体系；

（3）按一定的程序进行扩增；

（4）电泳检测扩增结果。

所述反应体系以下：