[发明专利]一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用

权利要求书

1.一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用，其特征在于，其包括如下实现步骤：

设计了两对引物，内参引物以及检测引物，一对内参引物位于CGG重复区的5’端；另外一对检测引物跨越整个CGG重复区；

所述扩增的内参引物序列为：

SEQ NO.1 F：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’

SEQ NO.2 M：5’-CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3’

所述扩增的检测引物序列为：

SEQ NO.3 F1：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’

SEQ NO.4 R：5’-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3’。

2.根据权利1所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，检测的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记。

3.根据权利要求1 所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于: 所述方法的具体处理步骤如下：

（1）DNA 提取，取200μL DNA样本溶液用试剂盒提取DNA，采用核酸分析仪或分光光度计进行DNA浓度及纯度鉴定；

（2）反应体系的配置，在每一个反应孔中加入一定的反应体系；

（3）按一定的程序进行扩增；

（4）电泳检测扩增结果。

4. 根据权利要求3 所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）反应体系如下：

10×扩增缓冲液 5.0 ul；25mM Mg²⁺ 4.0 ul；10mM dATP 1.0 ul；10mM dTTP 1.0 ul；10mM dCTP 1.0 ul；10mM dGTP 1.0 ul；10mM 7-deza-dGTP 2.0 ul；二甲亚砜 3.0 ul；引物（SEQ NO.1 20 pmol/ul） 1.5 ul；引物（SEQ NO.2 20 pmol/ul） 1.0 ul；引物（SEQ NO.3 20 pmol/ul） 2.0 ul；无菌水 30.0 ul；模板DNA（10 ng/ul）2.0 ul。

5. 根据权利要求3 所述的检测FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）

按以下程序进行扩增：

95℃ 10min；

80℃ 8min；

向每个反应孔中加入5.0U的DNA扩增酶；

95℃ 45sec → 58℃ 1min → 72℃ 4min，10 个循环；

95℃ 15sec → 58℃ 1min → 72℃ 5min，20 个循环。

6. 根据权利要求3 所述的检测FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：所述电泳检测扩增结果步骤如下：配1.5% 琼脂糖凝胶，取9μL 扩增的产物与10 倍浓度上样缓冲液混匀后上样，120V 电泳30min，紫外判断PCR 结果。

7. 根据权利要求3 所述的检测FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征还在于通过凝胶电泳、毛细电泳等电泳方法分析样本中FRM1基因序列CGG重复和拷贝数。

8. 根据权利要求3 所述的检测FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：结果判读的标准如下

（1）在同一泳道出现两条条带，一条条带大小在DNA标记220bp处，另一条条带大小在DNA标记220bp和640bp之间，则表明样本的CGG序列重复数小于54，样本结果为正常；

（2）在同一泳道出现两条条带，一条条带大小在DNA标记220bp处，另一条条带大小在DNA标记640bp和1077bp之间，则表明样本的CGG序列重复数在54和200之间，样本结果为前突变；

（3）在同一泳道出现一条条带，这条条带大小在DNA标记220bp处；样本结果为全突变；

（4）在同一泳道未任何条带出现时，表明DNA提取出现问题，需要重新进行试验。

9. 根据权利要求1 ～ 8任一项所述的检测方法在检测FRM1基因序列CGG序列重复数中应用。