[发明专利]一种利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法。

背景技术

壳二孢氯素是1968年，首次由日本学者Tamura等从丝孢纲壳二孢属真菌蚕豆壳二孢（Ascochyta viciae）的代谢产物中分离得到的一种异戊烯酚类化合物（Tamura G, et al. J. Antibiot, 21: 539-544, 1968），具有抗病毒、抗肿瘤、抗细菌和镇静活性并且具有降低胆固醇及甘油三酯水平、降低血压，改善I型及II型糖尿病的作用(Hong S, et al.,J. Biol Chem,280(26): 25202-25209, 2005; Tsuruga M, et al., J. Antibiot, 60(1): 20-26,2007; Sakaguchi K, et al., Biochem Bioph Res Commun, 329(1): 46-50, 2005; Tsuruga M, et al., Apoptosis, 9(4): 429-435, 2004)，具有巨大的应用前景。

壳二孢氯素可由镰刀菌属（Fusarium sp.）（Ralph Henry Evans, et al., US3546073）、丛赤壳属（Nectria coccinea）（Andridge, et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2136-2141, 1972）、轮枝霉属（Verticillium sp.）（Satoshi T, et al., Chem. Pharm. Bull.，42(4)：953-956, 1994）、柱孢霉（Cylindrocarpon sp.）（Mio K, et al., J. Antibiot，66: 23–29, 2013）等多个真菌菌属的菌株产生，但上述菌株的代谢产物成分复杂并且壳二孢氯素的发酵单位都很低，均不超过50mg/L。由此可见，寻找壳二孢氯素高效菌株、提高壳二孢氯素发酵产量、开发出适宜于工业化的制备壳二孢氯素的工艺成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法。

本发明所利用的柱孢霉属真菌菌株，其保藏名称为NCC3746，其分类命名为柱孢（Cylindrocarponsp.），保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2013年6月19日，保藏编号为CGMCC No.7756。

本发明所利用的真菌菌株NCC3746，经宏观及显微形态特征及ITS序列比对分析将其鉴定为柱孢霉属（Cylindrocarpon sp.）。

本发明所述的柱孢霉属真菌菌株NCC3746鉴定方法为将菌株NCC3746的孢子液涂布于载玻片上，于400倍显微镜下进行显微形态观察。将菌株NCC3746的孢子液点种于4种通用培养基：CMA（玉米粉琼脂）、PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）、MA（麦芽粉琼脂）、CzA（察氏琼脂）中，26℃下培养14天，进行宏观形态观察。经过宏观及显微形态观察以及ITS序列的比对分析，将NCC3746鉴定为柱孢霉属。

本发明所述的柱孢霉属（Cylindrocarpon sp.）真菌菌株NCC3746是从四川省眉山市洪雅县瓦屋山原始森林土壤中分离得到的一株野生菌株。

本发明所述菌株NCC3746的土壤样品采集方法为用无菌铲铲去靠近植物根部土壤的表层的腐殖土，然后取距离地表深度为5-10cm的土样约30克置于已灭菌的纸袋中保存。

本发明所述的菌株NCC3746土壤样品的分离方法为取1克该样品加入到10mL无菌水中充分振荡，随后取1mL混悬液加入到另一支装有9mL无菌水的试管中充分振荡，依此类推进行梯度稀释直至10^-10浓度。每个浓度取0.2mL涂布PDA双碟，随后在26℃下进行静置培养，双碟培养周期为3-10天，在此期间从双碟中挑取形态不同的菌落于PDA（北京双旋）斜面中进行培养，斜面培养时间为14天。通过上述方法获得了一株真菌，将其命名为NCC3746。