[发明专利]一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定细菌胞外蛋白酶种类上的应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白酶种类鉴定技术领域，涉及一种利用蛋白酶谱的活性电泳检测技术和蛋白酶抑制剂反应对蛋白酶种类进行快速鉴定的应用方法。

背景技术

蛋白酶(proteases,proteinases)也称为肽酶(peptidases)，是一类能水解蛋白质和多肽水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，执行许多不同的生理功能。MEROPS数据库记录了蛋白酶及蛋白酶的肽类抑制剂的相关信息，根据催化中心参与催化的氨基酸的不同，在该数据库中蛋白酶可分成6大类：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和未知催化类型的蛋白酶。蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，占了世界酶类销售总额的60％，在食品、医药、纺织、制革、洗涤剂、化妆品、动植物蛋白以及废物处理等行业都有着很好的应用前景。

蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)是一类分子量较小的多肽或蛋白质，它们能与蛋白酶活性部位或变构部位结合抑制酶的活性。蛋白酶抑制剂根据其作用于酶的活性部位的不同，分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(巯基蛋白酶抑制剂)、金属羧肽酶蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。利用蛋白酶抑制剂可以研究蛋白酶活性中心的催化特性，初步推断蛋白酶的种类。

利用蛋白酶抑制剂检测蛋白酶的常规方法为，将蛋白酶与抑制剂混合反应后，根据福林酚法测定其对酪蛋白的酶活。该方法中使用的如果是纯酶，则可以直观的判断蛋白酶的类型，但如果是粗酶提取液，结果就不直观，那是由于粗酶液内含多种蛋白酶，利用该方法，只能粗略判断粗酶液中可能含有哪种类型的酶，并不能直观的看到具体是哪一种或几种蛋白酶被抑制。

本发明针对上述问题进行了技术改进，利用蛋白酶谱的活性电泳产物通过抑制剂加底物浸泡的方法解决了上述传统方法可能的造成的误差，可有效应用于蛋白酶谱定性的分析。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种更为快速、准确、简便的检测蛋白酶种类的新方法，应用该方法，可以不用分离纯化蛋白酶，不使用昂贵仪器，就可直观的对细菌胞外蛋白酶进行分类。大大的缩短了实验周期，实现对多种蛋白酶谱进行高通量快速检测。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，包括以下步骤：

a.制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝胶；

b.蛋白酶样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热；

c.电泳；

d.洗胶；

e.将胶放入含有不同蛋白酶抑制剂的底物溶液中浸泡；

f.反应显色。

步骤a制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝胶的过程如下：配制质量浓度为12.5％的分离胶：30％w/v凝胶贮备液1.6ml，pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl1.0ml，蒸馏水1.4ml，10％w/v过硫酸铵25μl，TEMED2.5μl；混匀后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入1ml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆盖液体；配制5％w/v的上层浓缩胶：30％w/v凝胶贮备液0.15ml，pH6.8的0.5mol/L Tris-HCl0.35ml，蒸馏水0.5ml，10％w/v过硫酸铵20μl，TEMED2.0μl；插入梳子，避免混入气泡，放置室温下。

步骤b中使用的不含β-巯基乙醇的加样缓冲液配方为：60mM Tris-HCl pH6.8、SDS2％w/v、溴酚蓝0.1％w/v、甘油25％v/v组成，加样时样品和加样缓冲液的体积比为4：1。

4、根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，

步骤c中电泳缓冲液为pH8.8的Tris-甘氨酸缓冲液；电泳在冰浴中进行；采用垂直板式不连续系统电泳方法，5mA稳流进样后，10mA稳流分离样品直至溴酚蓝指示剂到达胶的最前沿。

步骤d中电泳结束后，用预冷的2.5％Triton X-100v/v将胶洗三次，每次15min；然后用预冷的蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100。

步骤e中将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有5mM蛋白酶抑制剂和质量浓度为0.1-2％底物的溶液中，30-40℃温浴1-3h。