[发明专利]一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定细菌胞外蛋白酶种类上的应用

权利要求书

1.一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝胶；

b.蛋白酶样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热；

c.电泳；

d.洗胶；

e.将胶放入含有不同蛋白酶抑制剂的底物溶液中浸泡；

f.反应显色。

2.根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，

步骤a制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝胶的过程如下：配制质量浓度为12.5％的分离胶：30％w/v凝胶贮备液1.6ml，pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl1.0ml，蒸馏水1.4ml，10％w/v过硫酸铵25μl，TEMED2.5μl；混匀后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入1ml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆盖液体；配制5％w/v的上层浓缩胶：30％w/v凝胶贮备液0.15ml，pH6.8的0.5mol/L Tris-HCl0.35ml，蒸馏水0.5ml，10％w/v过硫酸铵20μl，TEMED2.0μl；插入梳子，避免混入气泡，放置室温下。

3.根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，

步骤b中使用的不含β-巯基乙醇的加样缓冲液配方为：60mM Tris-HCl pH6.8、SDS2％w/v、溴酚蓝0.1％w/v、甘油25％v/v组成，加样时样品和加样缓冲液的体积比为4：1。

4.根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，

步骤c中电泳缓冲液为pH8.8的Tris-甘氨酸缓冲液；电泳在冰浴中进行；采用垂直板式不连续系统电泳方法，5mA稳流进样后，10mA稳流分离样品直至溴酚蓝指示剂到达胶的最前沿。

5.根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，

步骤d中电泳结束后，用预冷的2.5％Triton X-100v/v将胶洗三次，每次15min；然后用预冷的蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100。

6.根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，

步骤e中将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有5mM蛋白酶抑制剂和质量浓度为0.1-2％底物的溶液中，30-40℃温浴1-3h。

7.根据权利要求6所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，

将胶浸泡在用pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制的含有5mM蛋白酶抑制剂和质量浓度为0.1％底物的溶液中，37℃温浴1h后用蒸馏水将胶上残留的底物冲洗干净。

8.根据权利要求1或6或7所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟，1,10-邻菲啰啉或EDTA。

9.根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，

步骤f的具体过程为：用0.1％w/v的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，然后用脱色液脱色直至透明条带清晰，其中染色液配方为：1g考马斯亮蓝R-250，350ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml；脱色液配方为：250ml乙醇,100ml乙酸,加水至1000ml。

10.根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，蛋白酶样品来源于将细菌菌株接种于发酵培养基，在相应培养条件下震荡培养3～4天，4℃,13000rpm离心10min后得到的上清液，或是其他来源的蛋白酶液。