[发明专利]制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法。

背景技术

肠激酶（Enterokinase，简写为EK）是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。其天然蛋白分子量为150kDa，由一条115kDa的重链和一条35kDa的轻链组成，在pH值4.5-9.5和温度4-45^OC之间均可以特异性的水解蛋白底物。肠激酶识别底物蛋白的序列为DDDDK，它可以在赖氨酸残基的C端进行切割。这样的酶切优势使其成为了融合蛋白表达体系中理想的工具酶。天然提取的肠激酶很容易混有其它种类蛋白酶，限制了其在基因工程中的广泛应用。因此利用基因工程重组制备肠激酶逐渐成为大家选择的方向。

肠激酶由一条重链和一条轻链组成，重链又称结构亚基，轻链又称催化亚基，二者通过分子间二硫键结合。结构亚基负责将肠激酶定位到小肠的刷状缘膜上，催化亚基行使催化活性，将胰蛋白酶原激活成为胰蛋白酶。为了高效获得制备肠激酶催化亚基蛋白，有必要开发基因工程重组肠激酶催化亚基。

发明内容

本发明为了解决然提取的肠激酶很容易混有其它种类蛋白酶，限制了其在基因工程中的广泛应用，提供了一种制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其步骤为：

⑴在牛肠激酶催化亚基的基因EKL上构建突变体EKLM，突变体EKLM的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

⑵替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列EKLMO，EKLMO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

⑶在EKLMO的5`末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列，在EKLMO的3`末端加入标签序列，得到完整的表达基因片段；

⑷将上述表达基因片段克隆进入载体，构建得到高效表达载体，将其转入大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组基因的表达；

⑸收集菌体，提纯目的蛋白。

本发明步骤⑴在牛肠激酶催化亚基的基因EKL上构建突变体EKLM，目的在于提高重组蛋白的活性和稳定性，突变位点包括C112S，S121P，Y175R。步骤⑵中为了便于在大肠杆菌中的表达，替换掉不利表达的密码子从而获得优化的基因序列EKLMO。步骤⑶中在EKLMO的5`末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列DDDDK，便于重组蛋白自酶切。

进一步，所述步骤⑶中标签序列为四个连续的组氨酸标签序列HIS₄。所述的标签序列除了采用本发明提到的四个连续的组氨酸标签序列HIS₄，还可采用本领域常用的其它标签序列，例如Flag标签，HA标签，GST标签等等。

进一步，所述步骤⑸中提纯目的蛋白采用的是包涵体变复性方法。

本发明提到的包涵体变复性方法可以有多种实现方法，但是通过发明人常识多种方法之后，筛选得到了高产率的变复性方法，该方法相对于其他一般的包涵体变复性方法其产率至少可以提高500%。所述的包涵体变复性方法的步骤为：

①按照每10g菌体加入30ml比例加入到溶液A中重悬，破碎细胞，高速离心获得包涵体；所述溶液A为50mM Tris，pH 7.0；

②利用溶液B清洗包涵体两次；溶液B为50mM Tris，pH 7.0，500mM NaCl，20mM EDTA，2% Triton X-100；

③向包涵体中加入20倍包涵体质量的溶液C，溶解24h；溶液C为7.5M盐酸胍，pH 9.0，50mM Tris，100mM巯基乙醇；

④溶解24h后将溶液pH调整至3.5，采用溶液D进行透析；透析完成后，高速离心去掉沉淀，上清逐渐滴加到10倍上清体积的复性溶液E中；所述溶液D为7.5M盐酸胍，50mM Tris，pH 4.0；所述复性溶液E为0.7M 精氨酸，pH 8.6，2mM 还原性谷胱甘肽，1mM EDTA；

⑤复性72h后，采用溶液F对添加有上清的复性溶液E进行透析，透析完成后，高速离心去掉沉淀，获得目的蛋白溶液；溶液F为20mM Tris，PH7.6，20mM NaCl，1mM CaCl₂。

通过包涵体变复性提纯获得目的蛋白溶液后采用镍离子亲和柱快速纯化目的蛋白。通过该纯化处理产物浓度可以得到有效地提高，SDS-PAGE分析纯化处理后的目的蛋白纯度在95%以上，浓度超过1mg/ml。