[发明专利]制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法

权利要求书

1.制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，其步骤为：

⑴在牛肠激酶催化亚基的基因EKL上构建突变体EKLM，突变体EKLM的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

⑵替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列EKLMO，EKLMO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

⑶在EKLMO的5`末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列，在EKLMO的3`末端加入标签序列，得到完整的表达基因片段；

⑷将上述表达基因片段克隆进入载体，构建得到高效表达载体，将其转入大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组基因的表达；

⑸收集菌体，提纯目的蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，所述步骤⑶中标签序列为四个连续的组氨酸标签序列HIS₄。

3.根据权利要求1或2所述的制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，所述步骤⑸中提纯目的蛋白采用的是包涵体变复性方法。

4.根据权利要求3所述的制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，所述包涵体变复性方法的步骤为：

①按照每10g菌体加入30ml比例加入到溶液A中重悬，破碎细胞，高速离心获得包涵体；所述溶液A为50mM Tris，pH 7.0；

②利用溶液B清洗包涵体两次；溶液B为50mM Tris，pH 7.0，500mM NaCl，20mM EDTA，2% Triton X-100；

③向包涵体中加入20倍包涵体质量的溶液C，溶解24h；溶液C为7.5M盐酸胍，pH 9.0，50mM Tris，100mM巯基乙醇；

④溶解24h后将溶液pH调整至3.5，采用溶液D进行透析；透析完成后，高速离心去掉沉淀，上清逐渐滴加到10倍上清体积的复性溶液E中；所述溶液D为7.5M盐酸胍，50mM Tris，pH 4.0；所述复性溶液E为0.7M 精氨酸，pH 8.6，2mM 还原性谷胱甘肽，1mM EDTA；

⑤复性72h后，采用溶液F对添加有上清的复性溶液E进行透析，透析完成后，高速离心去掉沉淀，获得目的蛋白溶液；溶液F为20mM Tris，PH7.6，20mM NaCl，1mM CaCl₂。

5.根据权利要求4所述的制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，通过包涵体变复性提纯获得目的蛋白溶液后采用镍离子亲和柱快速纯化目的蛋白。