[发明专利]甾体羟化杂质的去除方法

说明书

技术领域

本发明涉及化合物杂质的去除方法，具体涉及甾体羟化杂质的去除方法。 

背景技术

采用微生物转化的方法，几乎可以在甾体母核的所有位置进行羟化反应。采用微生物转化方法实现甾体特定位置的羟化反应较化学合成方法专一性强。但在一些实际应用中其羟化反应也存在着副反应和副产物的生成，如1998年Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic5中公开了Anto′nia Jekkel采用雪腐镰孢转化得到15α-羟基-13-乙基-甾体-4-烯-3，17-双酮时，发现存在7，15双羟化物的副产物。申请人在采用霉菌转化制备11α-羟基-13-乙基-甾体-4-烯-3，17-双酮时发现最大的副产物为10，11位双羟化物。这些双羟化合物杂质很多都是因为羟化酶的特异性差而产生的。 

现有技术中甾体羟化杂质(单羟化物)的去除方法主要有两种： 

一种是重结晶法，其原理是通过目标产物与杂质在某种溶媒中的溶解度差异以及它们的溶解度随温度变化的差异来分离，纯化目标产物，最终将杂质留存于母液中，而目标产物得以结晶析出。采用该方法分离纯化羟化物，在重结晶时析出的晶体中，由于杂质的理化性质的近似，双羟化物会与目标产物一同析出结晶，从而影响终产品的质量，若通过反复重结晶终产品的收率将受到很大的影响。 

另一种是柱层析法，该方法选择合适的洗脱剂(一般是有固定配比的混合溶媒)冲洗装载粗品的硅胶柱，通过目标产物与杂质在硅胶柱中的迁移差异来分离，纯化目标产物。对于柱层析方法，首先需要选择合适的洗脱剂，双羟化物和目标产物(甾体羟化物)性质接近，导致洗脱剂的选择范围很小，在洗脱过程中经常也不能完全分离，而产生“夹带”现象，最终导致了分离效果不佳，产品收率和质量受影响。同时采用柱层析方法，通常对于实验室规模的样品较为方便可行，在工业化生产规模，会遇到诸如洗脱剂使用量和硅胶粉使用量过于庞大，装柱操作复杂对操作者技能要求较高等问题，另外在实际操作中还需要经常检测洗脱液组分，如采用TLC方法检测，操作繁琐，影响效率。 

综上所述，在采用微生物方法获得甾体的羟化物的过程中，甾体的双羟化物是经常出现的主要杂质，而它与目标产物在结构上只有甾体某一位置的一个羟基的差异，其溶解度和极性与目标产物性质很接近，这就导致了采用重结晶或柱层析的分离纯化方法难以有效的去除 甾体双羟化物杂质。 

目前文献没有关于甾体羟化反应的产物中双羟化物的分离纯化方法的报道。 

发明内容

为了解决现有技术中甾体羟化杂质去除困难的问题，尤其是甾体双羟化物去除困难的问题，本发明提供一种杂质去除效率高，产品收率高，生产操作方便，对设备、人员要求较低，适于大规模生产的甾体双羟化物的去除方法。 

实现本发明的技术方案为： 

本发明提供一种甾体双羟化物的去除方法，包括如下步骤： 

1)制备粗品 

通过生物转化的方法制备粗品； 

2)粗品的处理 

对粗品进行脱色处理； 

3)混合溶媒结晶除杂 

采用体积重量比5-30倍的含氯碳氢化合物溶解粗品，加入脂肪或环状脂肪碳氢化合物溶剂析出结晶，其中脂肪或环状脂肪碳氢化合物与含氯碳氢化合物的体积比为1-2∶1，得到精制品。 

其中步骤2)的粗品的脱色处理是由于生物转化得到的甾体粗品通常含有色素、多糖、杂蛋白、细胞破碎物等，这些物质的存在会影响步骤3)的除杂精制效果，所以需要预先对粗品进行处理，采用活性炭吸附处理可以有效的去除以上的杂质。 

上述步骤2)中的粗品的处理中脱色处理采用将粗品溶解于体积重量比(V/M)20-40倍的含有C1-C4的醇类、酯类或酮类的有机溶媒中，然后加入活性炭进行脱色。 

其中的C1-C4的醇类为甲醇、乙醇或丙醇；酯类为乙酸乙酯；酮类为丙酮。 

上述步骤3)中的含氯碳氢化合物为二氯甲烷或氯仿。 

上述步骤3)中的脂肪或环状脂肪碳氢化合物溶剂为正己烷、环己烷或甲基环己烷。 

本发明进一步提供甾体双羟化物的去除方法，包括如下步骤： 

1)制备粗品 

经过生物转化的发酵液(或菌体)采用常规方法提取获得浓缩液，浓缩液经过减压浓缩得到粗品； 

2)粗品的脱色处理