[发明专利]冬虫夏草中国被毛孢磷脂酶C、编号基因及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C(Laccase)，编码这个酶的基因及其应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。

但是，对冬虫夏草中国被毛孢中磷脂酶C的研究几乎为空白，尤其在参与中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C的研究上。

磷脂酶是在生物体内存在的可以水解甘油磷脂的一类酶,其中主要包括磷脂酶A1、AC、B、C和D，它们特异地作用于磷脂分子内部的各个酯键，形成不同的产物，被广泛用于甘油磷脂的改造。磷脂酶C(EC:3.1.4.3)可以催化PIP2分解产生1,4,5-肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)两个第二信号分子，是存在于胞浆膜上的一个关键酶。

2001年，查纻光等人从广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)毒腺中抽提总RNA，经mRNA纯化后构建了金环蛇毒腺cDNA文库。根据已发表的眼蛇科蛇毒磷脂酶A[2]基因序列中的保守区设计探针筛选克隆，得到2个磷脂酶A[2]基因。测定两者序列，其cDNA的阅读框均为435bp，编码145个氨基酸的磷脂酶A[2]前体。

2002年，李伟琳用探针从紫红链霉菌2917基因组文库中克隆出磷脂酶A3基因，经双向测序，确定了其基因的全序列，并由此推导出其氮基酸序列，将此序列与其他来源的磷脂酶A2基因序列进行了比较研究，结果显示，与天蓝色链霉菌A3(2)中磷脂酶A2的同源性为98％，与蛇毒的磷脂酶A2的同源性小于10％。

2007年，卢冬梅等人从超嗜热需氧古细菌Aeropyrum pernix K1中抽提出染色体基因组，经PCR扩增得到磷脂酶A2基因，用带有His-tag标记的pET15b作为表达载体，在大肠杆菌BLP中成功地诱导表达。表达产物经过Ni.螯合柱一步得到纯化。SDS-PAGE检测只有一条带，其准确分子量为17.871kD。

2007年，罗滟苏等人应用衔接头PCR技术，以蓝猪耳(Torenia fournieri)全基因组DNA分别经DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和SmaⅠ消化后与衔接头连接产物为模板，用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR，先后克隆到2个798和813bp的TfPLC1基因上游序列，经测序、blast比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列，共1432bp。

2010年，徐贤广等人研究牛分枝杆菌(M.bovis)溶血磷脂酶基因在致病机理中的作用，本研究构建了表达M.bovis的溶血酶(LIP)基因的重组质粒pET30a-LIP，经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，SDS-PAGE分析表明，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的20％，该蛋白经电洗脱纯化后，纯度达95％以上。

2011年，JS Seo等人从牙鲆的cDNA上通过cDNA末端(RACE)快速扩增克隆到了一个磷脂酶C基因。该cDNA编码含有一个高度保守的PH结构域，催化X和Y结构域，C2结构域1244个氨基酸长度的多肽。