[发明专利]一种分泌表达PEDV核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物生物医药工程领域，更具体地，涉及一种分泌表达猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是世界性的猪传染病之一，1978年在英国首次被报道，随后在包括我国在内的世界多个地区爆发流行，对各国养猪业造成重大损失。PED在亚洲的爆发引起极高的死亡率，有研究显示日本1993～1994年爆发PED时，5个猪场仔猪死亡数就超过一万，死亡率在30%～60%；据报道从2010年2月到2011年11月，我国爆发PED引起的仔猪死亡数在五万以上，死亡率高达90%～100%。2013年，美国也首次报道了PEDV的存在，2014年持续爆发与流行。

PEDV在被发现后直至今日，不但没有被有效控制，反而成了影响全世界养猪业的重大病毒，造成巨大的经济损失。目前对于PED的预防主要是接种疫苗，虽然国内PEDV的灭活苗及弱毒活疫苗得到了广泛的推广和应用，在一定程度上减少了PED的发病率，但仍无法完全控制。从目前国内外对PEDV的研究结果及应用效果看，仔猪主要通过初乳获得母源sIgA，产生对冠状病毒性腹泻的被动免疫保护，血清中的循环抗体IgG不能提供保护，也就是经非肠道免疫不能产生母源免疫。针对PEDV的快速变异和肠道粘膜免疫特点，不断研制安全的，可口服的新型疫苗来提高疫苗的免疫效果显得尤为重要。

PEDV的部分保护性抗原基因（COE基因）编码的部分S糖蛋白具有抗原性，能够诱导机体产生中和抗体。由于血清抗体的免疫效果不理想，肠道粘膜免疫产生的分泌型抗体（sIgA）是抵抗PEDV感染的有效抗体。因此，选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统，有效地刺激粘膜免疫系统产生粘膜免疫应答对本病的防治具有重要意义。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是乳球菌属中最重要和最典型的一个种，在食品工业中应用广泛，被公认为安全的（generally-regarded-as-safe，GRAS）食品级微生物。以乳酸乳球菌作为宿主菌表达异源蛋白和酶，逐渐成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中针对PEDV疫苗免疫效果不佳的缺陷，提供一种分泌表达PEDV核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌的制备方法。

本发明的第二个目的是提供上述方法制备得到的分泌表达PEDV核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌。

本发明的第三个目的是提供所述重组乳酸菌作为口服疫苗在预防猪流行性腹泻中的应用。

  本发明的第四个目的是提供一种预防猪流行性腹泻口服疫苗。

  本发明的第五个目的是提供上述预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为设计多条引物，采用重叠延伸PCR的方法将信号肽等序列连接到经密码子优化的COE基因上，以Usp45信号肽实现COE蛋白的分泌表达，以增强序列(LEISSTCDA)及其插入位置实现表达量的增加。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

    提供一种分泌表达猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 人工合成经密码子优化后的COE基因，设计多条引物，采用重叠延伸PCR的方法将Usp45信号肽序列连接到COE基因上；

S2. 将S1获得的COE基因连接至pNZ8048并筛选得到重组质粒pNZ8048-COE；采用电转化法将pNZ8048-COE重组质粒导入乳酸乳球菌L.lactisNZ9000中，获得重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000/pNZ8048-COE；

S1所述经密码子优化后的COE基因序列如SEQ IDNO：1所示，各引物序列如SEQ ID NO：2～9所示；所述筛选重组质粒的引物序列如SEQ ID NO：10～11所示。