[发明专利]一种分泌表达PEDV核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种分泌表达猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 人工合成经密码子优化后的COE基因，设计多条引物，采用重叠延伸PCR的方法将Usp45信号肽序列连接到COE基因上；

S2. 将S1获得的COE基因连接至pNZ8048并筛选得到重组质粒pNZ8048-COE；采用电转化法将pNZ8048-COE重组质粒导入乳酸乳球菌L.lactisNZ9000中，获得重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000/pNZ8048-COE；

S1所述经密码子优化后的COE基因序列如SEQ IDNO：1所示，各引物序列如SEQ ID NO：2～9所示；所述筛选重组质粒的引物序列如SEQ ID NO：10～11所示。

2.根据权利要求1所述重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，S1所述重叠延伸PCR的反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸5s，30个循环；72℃后延伸10min。

3. 根据权利要求1所述重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，S2所述电转化法为：取L. lactis NZ9000感受态细胞，加入pNZ8048-COE重组质粒，混匀并转入电转化杯，电击后加入恢复培养基，冰浴后静置培养，平板筛选高拷贝转化子。

4. 权利要求1至3任一项所述方法制备得到的重组质粒pNZ8048-COE和重组乳酸菌乳球菌L.lactisNZ9000/pNZ8048-COE。

5. 权利要求4所述重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000/pNZ8048-COE在制备预防猪流行性腹泻口服疫苗中的应用。

6. 一种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000/pNZ8048-COE接种于G-M17C液体培养基，静置培养过夜，取过夜培养物以一定比例接种于G-M17液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，加入诱导剂Nisin至终浓度为1～2 ng/mL，诱导一定时间，诱导后的全培养物直接作为口服疫苗。

7. 权利要求6所述方法制备得到的预防猪流行性腹泻的口服疫苗。