[发明专利]一种HPV高危型荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)高危型荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据HPV不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为高危型和低危型两大类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。

HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤为宫颈癌。全世界每年约有50万妇女宫颈癌新发病例，其中亚洲约占38万；每年约有27万女性死于子宫颈癌。在不同地区、不同经济状况的国家宫颈癌的发病率和死亡率有着显著的差别，其中80％的病例发生在发展中国家。我国每年约有15万宫颈癌新发病例，每年约有3万人死于子宫颈癌，其死亡率居妇科肿瘤的第二位。近年来，宫颈癌病人数目在逐渐上升，并呈年轻化的趋势。

对宫颈癌的病因学研究可知，高危HPV持续感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。临床研究显示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年。因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。在检出的所有型别中主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，因此，快速、准确的检测出HPV高危型的感染对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。

目前，国内外对于宫颈癌的早期筛查方法主要有细胞学检测和分子生物学检测。细胞学的检测方法，有宫颈巴氏(Pap)涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查(TCT)等多种。宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30％。TCT法大大改进了细胞学检查的准确性，逐渐取代传统的巴氏法。可观察宫颈上皮血管微小变化的阴道镜检查虽敏感、准确，但会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。由于宫颈HPV感染多为隐性亚临床感染，且HPV不能在培养环境中稳定生长，大部分HPV感染无临床症状或为亚临床感染但可致严重后果，因此，该感染不能作为一个普通的临床疾病或通过常规筛查计划或性传播疾病调查得以发现，只能通过HPV DNA检测得知。

因此，分子生物学技术渐渐显现了其在检测上的优势，目前认为PCR技术是检测HPV DNA及分型的最好方法。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。大量研究表明用PCR技术检测HPV DNA的阳性率远高于其他检测技术，是当今用于HPV感染诊断最常用的有力工具，且能更好的应用于HPV致病、致癌机理的研究之中。

结合国内情况，在临床高危型人乳头瘤病毒感染的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，目前已有少量荧光PCR诊断试剂盒在临床高危HPV感染诊断中常规使用，但是缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。

运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。

目前国内临床上主要采用煮沸法对人乳头瘤病毒的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。