[发明专利]一种基于酶联免疫分析的HPV核酸检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、免疫学及核酸化学技术领域。具体涉及一种基于酶联免疫分析的HPV核酸检测试剂盒及其应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(以下简称HPV)是环状双链DNA病毒，属于乳头瘤病毒科，α乳头瘤病毒属。自20世纪70年代被首次发现以来，现已公布HPV的基因型已有100种以上。其中一些基因型已经被证实与多种上皮或粘膜组织的恶性病变有关，尤其是是子宫颈癌。在全球的女性中，子宫颈癌是仅次于乳腺癌的普遍存在的恶性肿瘤。在美国，每年有1.2万名女性被诊断为宫颈癌。目前已经公认，HPV是导致全球几乎所有宫颈癌的因素。HPV导致了99％的宫颈癌，而高危HPV基因型16和18占到了70％。更重要的是，该病毒中的E6和E7基因及其转录翻译产物是决定其侵袭和治病能力的关键因素。

几十年来，女性一直依靠细胞学检查作为检测子宫颈癌存在与否的工具。女性需要获取更好的筛查工具，包括HPV初级筛查，以降低罹患子宫颈癌的风险。现在诊断HPV感染的方法很多，比如：组织学、血清学及分子生物学等。但是，目前为止基于HPV病毒本身的特点，还不能进行体外培养，因此培养法还不现实；另外，由于针对HPV的免疫分析缺乏足够的灵敏度和特异性，血清或蛋白检测也未能应用于临床。因此，目前用于HPV检测的方法还依赖于其核酸(DNA或RNA)，例如，针对DNA的检测有基于原位杂交、DNA测序方法的直接法，基于分枝DNA分析、杂交捕获系统和Cervista高危HPV检测方法的信号放大法，基于Real-Time PCR、整合HPV序列PCR(DIPS-PCR)的靶扩增分析；针对RNA的检测有反转录PCR、基于核酸序列扩增(NASBA)法和转录介导的扩增(TMA)法等。其中，值得注意的是2003年FDA批准的Qiagen公司的Hybrid Capture2法和2014年FDA批准的罗氏(Roche)公司的cobas HPV Test法。

然而，以上针对HPV核酸的检测方法也有其不足之处，比如，有些方法操作相对复杂、困难导致成本较高，有些方法除需要相应的扩增和检测仪器还不能真实的反映出初始的病毒载量。而病毒载量却是与病人的病程和病毒传播危害程度相关的重要因素。目前研究表明，以高危HPV基因组DNA>1pg/ml(100,000HPV拷贝)为阈值，宫颈上皮肉瘤变(CIN)II-III期中阳性率为97.5％，CIN III期中阳性率为100％，宫颈癌中阳性率为100％。因此，理想的HPV的检测方法应该是基于核酸的杂交分析不需扩增HPV的靶核酸。

单克隆抗体Sdr是鼠源的针对DNA:RNA杂合体的高特异性和亲和力的抗体。我们的专利技术即是建立了一种利用Sdr单克隆抗体检测高危HPV16型E6、E7RNA的免疫检测方法，该方法不需反转录和PCR技术对待检靶序列进行扩增，而是利用不需标记的DNA探针与HPV16型E6、E7RNA进行杂交，形成DNA：RNA杂合体，然后利用Sdr单克隆抗体进行识别和后续的信号放大。检测方法具有快速、低成本、高灵敏、不需复杂的扩增和检测仪器，以及可检测初始病毒载量的优点。

发明内容

本发明需要解决的问题：针对现有HPV核酸的检测方法的不足之处，比如操作相对复杂、困难导致的成本较高，需要相应的扩增和检测仪器，不能真实的反映出初始的病毒载量。提供一种快速检测HPV的方法和试剂，并组装成检测试剂盒,并确定试剂盒的使用方法，可对高危HPV16型E6、E7RNA进行快速、低成本、高灵敏检测，检测过程不需复杂的扩增和检测仪器，可检测初始病毒载量。

本发明的总体技术路线：样本的采集、处理，从病样(血液、组织，宫颈分泌物、细胞脱落物等)提取HPV16型DNA或RNA；根据GenBank公布的标准序列设计的引物进行克隆，序列分析；根据GenBank公布的标准序列设计与靶核酸进行杂交的寡核苷酸片段(探针)；在特定的杂交条件下，寡核苷酸探针与待检核酸进行杂交；杂交产物结合于PLL预先包被的酶标板上；加入针对DNA-RNA杂合体的单克隆抗体；加入抗单克隆抗体的酶标二抗；加入酶的底物显色，终止反应后测吸光度值。对实验流程中的关键反应条件、试剂成分及浓度进行优化，将探针混合液，退火缓冲液，一抗、二抗稀释液，底物显色液，反应终止液开发成检测HPV16型E6、E7RNA的试剂盒。