[发明专利]水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境及农业生产上水仙退化病毒的快速检测和监测。

背景技术

水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus，NDV)为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，病毒基因组全长约9,816bp，为正义单链RNA，不含polyA尾，该病毒在受侵染的水仙叶肉细胞内产生典型的风轮状内含体。该病毒最早在英国多花水仙变种(Narcissus tazetta cv.Grand Soleil d’Or)上发现，在受侵染的水仙叶片上表现为褪绿条纹症状。NDV实验寄主较窄，主要局限在石蒜科(Amaryllidaceae)的几种植物上，可以摩擦接种的植物包括中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis Roem)、红口水仙(Narcissus poeticus)、喇叭水仙(Narcissus pseudonarcissus)三种水仙和石蒜(Lycoris radiata)植物。NDV的基因组全序列大小为9816个核苷酸，具有马铃薯Y病毒属病毒典型的基因组结构，含一个大的开放阅读框(ORF)，编码的一个3184个氨基酸残基的多聚蛋白，分子量为363.4KDa。NDV病毒粒体为细丝状，主要经由蚜虫介体在其植株间进行传播。NDV在血清学关系上与马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)具有血清学相关性，但与另一同为马铃薯Y病毒属病毒的水仙迟黄病毒(Narcissus late season yellows virus,NLSYV)没有血清学关系。此外，NDV还能够与其他植物病毒复合侵染水仙，影响水仙的品质，造成水仙商品价值在不同定程度上降低。

目前，NDV主要分布在英国、德国、新西兰、澳大利亚、中国等水仙栽培区。NDV的远距离传播主要依靠携带该病毒的植株及其产品的运输，因此加强该病毒的检测，有利于预防该病毒的发生和扩散。由于NDV寄主范围窄，且常出现复合侵染，利用传统的生物学检测方法检测尚未发现有效的鉴别寄主；利用电镜检测方法观察病毒粒具有直接而准确的优点，但其需专门的技术人员和昂贵的仪器设备，使其在口岸的应用上具有较大的局限性；ELISA检测方法灵敏度高、特异性强、操作简便，是目前广泛应用的一种血清学检测技术，但其局限性在于需要稳定性好、特异性强的病毒抗体。近年来，PCR技术广泛应用于植物病毒的检测，灵敏度高、特异性强。基于普通RT-PCR的巢式RT-PCR方法，能够降低多个靶标被扩增的可能，减少假阳性的出现，提高检测的灵敏度和可靠性，具有突出优点。但到目前为止，关于水仙退化病毒(NDV)巢式RT-PCR检测方法的报道甚少，至今尚未见专门应用于该病毒快速检测的巢式RT-PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对进出境及农业生产上水仙退化病毒进行快速、准确的检疫鉴定。

本发明技术方案如下：

(一)一种用于水仙退化病毒检测的巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)外侧正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-ACCGTTGGCATCACTAAG-3’；

2)外侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-ACTGGTTCCACGCTCCTA-3’；

3)内侧正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCGGTGATAACAATTCGAGA-3’；

4)内侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCTAAGTCCTTCAATTTCCGTC-3’；

5)RT Buffer：5×；

6)RNA酶抑制因子：40U/μL；

7)反转录酶：200U/μL；

8)dNTPs：10mmol/L；

9)PCR Buffer：10×；

10)Mgcl₂：25mmol/L；

11)Taq DNA聚合酶：5U/μL；

12)水仙退化病毒的阳性对照样品；

13)不含水仙退化病毒的阴性对照样品；

14)RNase-free ddH₂O。