[发明专利]水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)外侧正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-ACCGTTGGCATCACTAAG-3’；2)外侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-ACTGGTTCCACGCTCCTA-3’；3)内侧正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCGGTGATAACAATTCGAGA-3’；4)内侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCTAAGTCCTTCAATTTCCGTC-3’；5)RT Buffer：5×；6)RNA酶抑制因子：40U/μL；7)反转录酶：200U/μL；8)dNTPs：10mmol/L；9)PCR Buffer：10×；10)Mgcl2：25mmol/L；11)Taq DNA聚合酶：5U/μL；12)水仙退化病毒的阳性对照样品；13)不含水仙退化病毒的阴性对照样品；14)RNase-free ddH₂O。

2.利用权利要求1所述的水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA3μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL和RNase-free ddH₂O7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer2.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs1μL、浓度为200U/μL反转录酶0.5μL、浓度为40U/μL RNA酶抑制因子0.5μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cDNA；

2)第1轮PCR反应：取步骤1)合成的cDNA3μL，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L外侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O14.5μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；

3)第2轮PCR反应：取0.2μL稀释100倍后的第一轮PCR反应产物，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L内侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O17.3μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；

4)PCR扩增产物电泳检测：第2轮PCR反应结束后，取产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有水仙退化病毒样品的电泳检测结果为在393bp处出现明亮的DNA条带。