[发明专利]一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于食品安全领域的核酸检测。具体而言，本发明涉及沙门氏菌血清型的鉴定方法及试剂盒。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)为杆状的革兰氏阴性肠道菌，兼性耗氧，大多数菌株可在没有特殊生长因子的合成培养基上生长。沙门氏菌是极其重要的食源性致病菌，对人类和动物都具有极大危害，而且能够在人体与动物体间进行传播。近几十年来，由沙门氏菌引起的食物中毒占世界食物中毒病例的第一或第二位。我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的30％-90％，中毒人数占食物中毒总人数的60％-90％，而在细菌性食物中毒的病原中，沙门氏菌约为40％。沙门氏菌血清型的种类繁多，目前已达两千多种，有些沙门氏菌血清型与其致病性息息相关，而有些血清型并不致病。常见的食物中毒主要由一些特定的血清型感染引起，如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔比沙门氏菌等，因此对于研究沙门氏菌的致病机理及流行病学监测，血清型的鉴定是十分必要的。

当前，我国对于沙门氏菌的检测主要是依靠国标(GBT4789.4-2010)的方法，根据沙门氏菌的生化反应，以及抗原抗体反应进行分型鉴定。但是此方法存在一些缺陷，抗原和分型血清的制备比较复杂，另外，沙门氏菌的抗原与血清的凝集反应有时较为迟缓，反应较弱，易造成错误的分型结果。有些分子分型方法如脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)等，其分型结果也可以与不同血清型对应起来，但是PFGE法操作较为繁琐，对于操作者的技术水平要求很高，而MLST法需要同时扩增七个看家基因并进行测序和序列分析，耗时较长，成本较高。

建立一种行之有效的食源性沙门氏菌血清型的鉴定方法，以提高其血清型鉴定的速度和准确度，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品安全和口岸检疫中都有重要意义。

最近发现，在细菌和古菌中广泛存在着成簇规律间隔短回文重复序列，即CRISPR。沙门氏菌通常含有两个CRISPR系统，即CRISPR1和CRISPR2，它可以使细菌对噬菌体或质粒等外源DNA实现免疫，而CRISPR系统中的间隔序列在免疫过程中发挥着重要作用，是用来识别外源DNA的标签，不同的间隔序列与不同噬菌体或质粒上的序列存在高度同源性。同时，在细菌进化过程中间隔序列存在插入和选择性剔除的现象，使其具备多态性，进而在不同菌株间存在特征性的差异。

为此，本发明人经过长期研究，令人意外地研究出了一种基于沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列保守性的沙门氏菌血清型快速鉴定方法。

这种沙门氏菌血清型快速鉴定方法针对沙门氏菌血清型CRISPR位点中间隔序列特异性强，可有效区分沙门氏菌不同血清型，快速、灵敏，并可以应用于食源性沙门氏菌不同血清型的鉴定。

发明内容

有鉴于现有技术存在上述的问题，本发明的目的是提供一种快速、灵敏的沙门氏菌血清型鉴定方法。为此，本发明的技术方案为：一种沙门氏菌血清型的鉴定方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样品中的DNA；

2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测；其中，PCR检测的靶标为沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2；

3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定；

4)借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR位点的前三个间隔序列，并与各血清型标准间隔序列进行同源比对；

5)比对结果的判断：样品的CRISPR1和CRISPR2的间隔序列分别与某一标准血清型的CRISPR1和CRISPR2间隔序列至少有两个一致则判定为对应的血清型。

其中蒙得维亚沙门氏菌和伤寒沙门氏菌由于CRISPR2基因的扩增产物拷贝数过低或扩增产物片段太小，在测序时不能得出正确的序列信息，而通过多次分离株的验证，发现其CRISPR1基因的前三个间隔序列已经具有较强的血清型特异性，能够作为血清型鉴别的依据，故只需比对CRISPR1基因的前三个间隔序列即可。

本发明之所以选CRISPR1和CRISPR2的前三个间隔序列作为检测靶标是通过如下方法筛选得到的：