[发明专利]一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR‑SBT方法及试剂

说明书

技术领域

本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于人血小板同种抗原系统（Human Platelet Alloantigen，缩写为HPA）的抗原基因分型的分子生物学检测方法及该方法所用的试剂。

背景技术

血小板表面存在复杂的血型抗原，它不仅存在与红细胞共有的ABO、H、Lewis等糖链类抗原和与白细胞共有的HLA-I类抗原，还存在血小板自身特异性的同种抗原系统（human platelet alloantigen, HPA），人群中HPA系统表现出高度的遗传多态性。个体间HPA抗原的不同可通过免疫刺激而产生抗体，抗体能与供者相对应抗原相结合从而破坏血小板，导致血小板输注无效和其他相关性疾病，因此研究血小板同种抗原系统具有重要的意义，有助于疾病诊治和解决血小板输注问题。研究显示HPA基因定位于血小板糖膜蛋白和CD109基因上，目前共发现有28个抗原系统。

血小板同种抗原的差异可导致个体受免疫刺激产生抗体，已发现其抗体与多种疾病有关，包括新生儿同种免疫性血小板减少症、血小板输注无效和输血后紫癜等。其中血小板输注无效在临床输血治疗中常见，也是目前血小板输注中需要研究解决的热点问题。国内外已建立一些方法解决血小板输注无效，近年来国内开始建立献血者血小板同种抗原基因数据库，拟提供与患者血小板抗原系统基因型相合的献血者，以解决血小板输注无效问题。

目前HPA抗原基因分型最主要的方法是多聚酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP），该方法针对同一抗原系统需要设计两对引物进行扩增才能有效区分，因此对检测HPA的多个系统需要扩增的孔位较多，此外PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此对于一些特殊的新突变位点难以明确。而HPA系统的PCR-SBT（PCR-Sequence based typing，基于PCR测序的分型技术）分型方法可以克服上述局限性和不足，为目前最准确的分型的方法。但现阶段的HPA抗原基因PCR-SBT分型方法还不够完善，虽然也有实验室采用PCR-SBT的方法对HPA抗原进行基因分型，但至今未对HPA1-28w系统进行系统分型。因此，建立HPA1-28w系统的PCR-SBT分型方法具有重要的意义。

发明内容

本发明首先要解决的技术问题是提供一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，以克服现有分型技术中的上述不足之处。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，对HPA抗原系统的基因进行分型，并包括以下步骤：

（1）制备人基因组DNA；

（2）提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中抗原系统的基因序列；

（3）将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；

（4）提供测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；

（5）将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；

（6）将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定其基因型。

进一步地，所述HPA抗原系统为HPA1-28W抗原系统，所述的HPA1-28W抗原系统的基因为：HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6w、HPA-7w、HPA-8w、HPA-9w、HPA-10w、HPA-11w、HPA-12w、HPA-13w、HPA-14w、HPA-15、HPA-16w、HPA-17w、HPA-18w、HPA-19w、HPA-20w、HPA-21w、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-25bw、HPA-26bw、HPA-27bw、HPA-28bw。

进一步地，所述步骤（2）中的扩增引物为：

(1) HPA-1和HPA-10w抗原系统的基因序列的扩增引物，

HPA-1,10F: 5’ TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTTggCCTCCCA AAgTATCA 3’

HPA-1,10R: 5’TCCAAACTCATCAATgTATCCACCTgCTTCAggTCTCTCC3’

(2) HPA-2抗原系统的基因序列的扩增引物，

HPA-2F: 5’ TgTAAAACgACggCCAgTTATCCCACAATCAgCTgCAA 3’

HPA-2R: 5’ CAggAAACAgCTATgACCgAgATTCTCCAgCCCATTCA 3’