[发明专利]一种高效固定化脂肪酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效固定化脂肪酶的制备方法，属于酶化学技术领域。

技术背景

脂肪酶是一种生物催化剂，与化学催化试剂相比具有反应速度快、反应效率高、反应条件温和、底物专一性强以及可在中性pH条件下操作等优点，同时脂肪酶本身也是一种蛋白质，可以被微生物生物降解，符合绿色化学的要求，其已在食品、医药、轻工和农业等许多领域得到应用，尤其在食品加工中的应用越来越广泛。其中更以具有位置特异性的脂肪酶为代表，这类脂肪酶对于三酰甘油特定位置的脂肪酸优先水解，主要作用于三酰甘油的1位和3位，因此也被称为sn1,3位专一性脂肪酶，因其独特的性质被广泛应用于合成结构油脂，如合成低热量油脂、母乳脂肪替代品及新型脂质衍生物等。

虽然在合成结构油脂方面sn1,3脂肪酶具有反应高效，合成率高等优点，但脂肪酶的价格昂贵，在反应过程中也比较不稳定，而且很难回收重复再利用，种种缺陷使其在大规模应用上受到限制，因此目前用于工业生产结构油脂产品的主要还是化学方法。而酶的固定化就是为了克服以上限制，使酶能像化学催化剂一样在反应过程中稳定操作，且利于回收和反复使用而发展起来的一项技术。通过固定化可以改善酶的某些性质，如热稳定性和操作稳定性等，使其达到重复使用的目的，在一定程度上降低成本，推动了其在工业上的大规模应用。许多国内外学者采用吸附、交联、包埋及共价结合等固定化方法来提高脂肪酶的活性及稳定性，而吸附法是最常用的一种固定化方法。

目前，大多研究都是关于固定化提高脂肪酶的水解活性和酯交换活性，关于提高脂肪酶酸解活性的研究鲜见报道。酸解活性是指脂肪酶催化甘油三酯与脂肪酸之间发生酰基转移，从而改变甘油三酯结构组成的活性。脂肪酶酸解活性的提高在甘油三酯与脂肪酸作用合成结构油脂的研究中具有积极的意义。但是，在现有技术中一般的固定过程会对脂肪酶的高效性和专一性造成负面影响。对于1,3位专一性脂肪酶来说，固定化常常会使其专一性发生改变，从而失去在结构油脂合成方面的优越性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种高效固定化脂肪酶的制备方法，所采取的技术方案如下：

一种高效固定化脂肪酶的制备方法，是分别用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶和经预处理的大孔吸附树脂，再将脂肪酶溶液加入到大孔吸附树脂溶液中震荡均匀后，进行吸附处理，吸附后再加入戊二醛溶液进行固定处理，固定后经真空抽滤、洗涤和干燥后得到固定化脂肪酶。

所述方法的步骤如下：

1)大孔吸附树脂的预处理：将大孔吸附树脂加入到乙醇溶液中胀润，用去离子水洗涤后，再用分别用酸和碱交替处理树脂，蒸馏水冲洗至中性后，干燥，获得预处理大孔吸附树脂；

2)磷酸盐缓冲溶液的溶解：用磷酸盐缓冲溶液浸泡步骤1)所得预处理大孔吸附树脂，再用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶，获得脂肪酶溶液；

3)吸附处理：将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到经预处理的大孔吸附树脂磷酸盐溶液中，震荡混合后吸附处理，获得吸附树脂脂肪酶溶液；

4)交联处理：向步骤3)所得吸附树脂脂肪酶溶液中加入戊二醛溶液进行固定化处理，处理完后进行真空抽滤，用去离子水洗涤后干燥，得到固定化脂肪酶。

所述方法的步骤1)中所述大孔吸附树脂为NKA-9大孔吸附树脂；所述乙醇溶液浓度为90-95％，胀润时间为23-25h；所述用酸和碱交替处理是用4-5％的盐酸和1-2％的氢氧化钠溶液每处理4h交替；所述干燥，温度为37-40℃，时间为12-15h。

所述方法的步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液pH为6.7-7.0，浓度为0.05M；所述脂肪酶的添加量为34-35mg/100mg载体。

所述方法的步骤3)中所述吸附处理，吸附温度为40-45℃，吸附时间为4-4.5h，在吸附处理过程中每隔5-10min进行震荡混匀。

所述方法的步骤4)中所述戊二醛溶液浓度为0.25-0.75％；所述固定化处理，固定时间为2-3h；所述干燥，干燥温度为37-40℃，干燥时间12-15h。

所述方法的具体步骤如下：

1)称取500mg的NKA-9树脂，加入95％乙醇溶液浸泡胀润24h，用去离子水洗涤去除杂质，再分别用5％盐酸和2％氢氧化钠溶液处理NKA-9树脂，每处理4h交替，交替处理1次，再用蒸馏水冲洗至中性后，于37℃干燥15h，获得预处理NKA-9树脂；