[发明专利]一种利用糖脂制备CIK细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中细胞培养领域，具体涉及一种利用糖脂制备CIK细胞的方法。

技术背景

细胞免疫治疗是继手术、放疗、化疗之后，而且是最有希望完全杀死癌细胞的第四大肿瘤治疗技术。目前肿瘤治疗临床使用最多的手术、放疗、化疗，均有不同程度的毒副作用，除给患者带来巨大的生理痛苦和精神恐惧以外，它们在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞，尤其是杀伤人体中生长发育旺盛的血液、淋巴组织细胞等。而CIK细胞免疫治疗是一种无痛苦无副作用的“和谐”治疗、“绿色”治疗方法。CIK细胞免疫疗法适用于多种实体肿瘤，包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等实体瘤手术后防止复发治疗，也可以用于多发性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系统恶性肿瘤的复发治疗。

CIK细胞制备技术是细胞免疫治疗过程中最重要的技术环节，是指把患者外周血液中的提取的单个核细胞在体外通过特定操作步骤培养诱导为大量的可以直接杀死各种肿瘤细胞的CIK细胞。之后，得到的CIK细胞再被输入患者体内，从而达到治疗肿瘤的效果。CIK细胞是一种免疫活性细胞，增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MMC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

目前市场上已有的细胞诱导技术只使用IFN-γ、CD3单克隆抗体、IL-2和IL-1a作为细胞诱导剂来培养CIK细胞，培养周期较长、肿瘤细胞杀伤率较低。培养周期长，与肿瘤细胞混合后12小时杀伤率为75％。因此，有必要提供一种更有效的制备、激活CIK细胞的方法

发明内容

本发明的目的是提供一种CIK细胞的高效制备方法，即通过KRN8000糖脂和KRN9000糖脂联合刺激外周血单核细胞，获得大量的CIK细胞并提高CIK细胞的活性，从而弥补现有技术的不足。

申请人在长期的研究中发现，将KRN8000糖脂和KRN9000糖脂在CIK细胞的诱导培养过程先后适量添加后，可以刺激活化CIK细胞，使其快速增殖。由该方法制备得到的CIK细胞活化比例不低于80％，培养周期由三周缩短至两周，极大的提高了培养NK细胞的效率，使CIK细胞12小时杀伤百分率由75％提高至85％，从而促成了本发明。

本发明的方法，是在CIK细胞制备的过程中，首先在培养液中添加α1-Galactosylceramide糖脂(KRN8000)，然后再添加α2-Galactosylceramide糖脂(KRN9000)进行活化和增殖。

本发明的方法，具体可包括有如下的步骤：

1)首先把人体外周血单个核细胞按照1～2×10⁶个/ml的浓度悬浮于细胞培养液中；

2)在步骤1)的细胞培养液中加入1000U/ml的重组人IFN-γ及50ng/ml的KRN8000在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时；

3)然后在细胞培养液中加入50ng/ml的CD₃单克隆抗体，300U/ml的重组人IL-2和50ng/ml的KRN9000进行培养；

4)在培养至第8天再次补充添加重组人IL-2和KRN9000；再培养两周后收获CIK细胞。

其中步骤1)所使用的培养液，其配方组成如下: