[发明专利]一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种薯蓣皂素的生产方法，特别涉及一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法。

背景技术

薯蓣皂素，是合成甾体激素药物的重要中间体，广泛应用于消炎镇痛，脑血管，避孕药物的合成中。素有激素之母的美誉。世界上60％的甾体激素类药物都是以薯蓣皂素为原料进行生产的，对其需求量非常大。中国是薯蓣皂素生产和出口的大国，主要是从薯蓣属植物(盾叶薯蓣和穿龙薯蓣)中提取皂素的。其中盾叶薯蓣(俗名黄姜)是我国的特有品种，种植面积大，薯蓣皂素的含量高。

薯蓣皂素一般以薯蓣皂苷的形式存在于植物根茎中，既在薯蓣皂素配基的C-3和C-26位连接不同的糖基形成的。水解这两个位置的糖基即可得到薯蓣皂素。工业中一般利用强酸(H₂SO₄或HCI)在高温高压的条件下水解黄姜根茎获得薯蓣皂素，该过程称为酸水解。酸水解产生大量高COD，高盐，高色度的强酸性废水，非常难处理，严重污染当地环境。

与酸水解相比，生物催化反应条件温和，专一性强，是一种环境友好的方法。利用微生物或酶水解黄姜制备属于皂素已有报道。但是现有技术中酶水解成本较高，不适宜工业化生产，而微生物水解可以解决成本问题，但是效率不高。

发明内容

本发明的目的是提供低成本，效率高的微生物法生产薯蓣皂素的方法，以克服现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：

一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法，所述方法采用里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉组合发酵黄姜得到薯蓣皂素。其中里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉均购买于中国农业微生物菌种保藏中心，其中里氏木霉ACCC30597，绿色木霉ACCC30048和烟曲霉ACCC30556。

所述方法的具体步骤包括：

a.菌种的驯化：首先采用低浓度的黄姜乙醇提取物分别对前述三种菌种进行驯化培养，循环驯化多次后取薯蓣皂素含量最高的霉菌孢子再次转接至高浓度的黄姜乙醇提取物驯化培养液中继续驯化，最后将菌种保存在50％的黄姜乙醇提取物中。

其中黄姜乙醇提取物为90％乙醇提取物，即为总皂苷。

b.黄姜的预处理：黄姜原料洗净后烘干、粉碎、过筛，然后进行脱淀粉处理，再次粉碎过筛后，得到黄姜残渣；

c.菌种活化培养：从驯化后的菌种分别挑取孢子接种于活化培养基中，循环活化，活化后进行种子培养；

d.组合发酵：首先接种步骤c中得到绿色木霉，发酵一段时间后接种步骤c中得到的里氏木霉，继续发酵一段时间后，接种步骤c中得到的烟曲霉发酵一段时间，得到发酵产物；

e.产物处理：将发酵产物过滤后烘干，用有机溶剂提取，结晶干燥后得到产物。

进一步，所述步骤a中的菌种驯化的具体方法为：将里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉分别接种于无机盐培养基中，第一次驯化时，向培养基中加入1％黄姜乙醇提取物(即总皂苷浓度)，30℃水浴振荡培养7d；循环驯化3次后，选择薯蓣皂素含量最高摇瓶中的霉菌孢子转接至5％黄姜乙醇提取物(总皂苷浓度)驯化培养液中；依前述方法驯化10％和15％浓度，最后保存于50％黄姜乙醇提取物(总皂苷浓度)中。

进一步，所述无机盐培养基为NaNO₃ 0.3％；K₂HPO₄ 0.1％；FeSO₄ 0.001％；KCl 0.05％；MgSO₄·7H2O0.05％；pH值6.6。

进一步，所述菌种驯化后的保藏培养基为黄姜乙醇提取物(总皂苷浓度)50％；NaNO₃ 0.3％；K₂HPO₄ 0.1％；FeSO₄ 0.001％；KCl 0.05％；MgSO₄·7H2O0.05％；pH值6.6。

进一步，步骤b中黄姜的预处理两次过筛均为60目筛。

进一步，步骤c中菌种活化培养基为黄姜乙醇提取物(总皂苷浓度)5％；NaNO₃0.3％；K₂HPO₄ 0.1％；FeSO₄ 0.001％；KCl 0.05％；MgSO₄·7H₂O0.05％；pH值6.6。

进一步，步骤c中菌种的种子培养基为PDA培养基。