[发明专利]一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法

权利要求书

1.一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法，其特征在于，所述方法采用里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉组合发酵黄姜得到薯蓣皂素，具体步骤包括：

a.菌种的驯化：首先采用低浓度的黄姜乙醇提取物分别对前述三种菌种进行驯化培养，循环驯化多次后取薯蓣皂素含量最高的霉菌孢子再次转接至高浓度的黄姜乙醇提取物驯化培养液中继续驯化，最后将菌种保存在50％的黄姜乙醇提取物中；

b.黄姜的预处理：黄姜原料洗净后烘干、粉碎、过筛，然后进行脱淀粉处理，再次粉碎过筛后，得到黄姜残渣；

c.菌种活化培养：从驯化后的菌种分别挑取孢子接种于活化培养基中，循环活化，活化后进行种子培养；

d.组合发酵：首先接种步骤c中得到绿色木霉，发酵一段时间后接种步骤c中得到的里氏木霉，继续发酵一段时间后，接种步骤c中得到的烟曲霉发酵一段时间，得到发酵产物；

e.产物处理：将发酵产物过滤后烘干，用有机溶剂提取，结晶干燥后得到产物；步骤d中组合发酵的发酵培养基为黄姜残渣25-30％，Tween 80 1-1.2％，蛋白胨2.5-3％，K₂HPO₄0.2-0.3％，pH 5.5-6；置于超声发生器中，25-50KHz超声15min；超声后的培养基121℃灭菌30min；

步骤d中组合发酵的发酵条件为：固体浅盘发酵室，相对湿度80-90％，温度30-35℃，通无菌风1-1.5vvm；首先接种绿色木霉，搅拌均匀，发酵1天后接种里氏木霉，搅拌均匀，发酵1天后接种烟曲霉搅拌均匀发酵5天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中的菌种驯化的具体方法为：将里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉分别接种于无机盐培养基中，第一次驯化时，向培养基中加入1％黄姜乙醇提取物，30℃水浴振荡培养7d；循环驯化3次后，选择薯蓣皂素含量最高摇瓶中的霉菌孢子转接至5％黄姜乙醇提取物驯化培养液中；依前述方法驯化10％和15％浓度，最后保存于50％黄姜乙醇提取物中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无机盐培养基为NaNO₃ 0.3％；K₂HPO₄0.1％；FeSO₄ 0.001％；KCl 0.05％；MgSO₄·7H₂O 0.05％；pH值6.6。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种驯化后的保藏培养基为黄姜乙醇提取物50％；NaNO3 0.3％；K₂HPO₄ 0.1％；FeSO₄ 0.001％；KCl 0.05％；MgSO₄·7H₂O 0.05％；pH值6.6。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中菌种活化培养基为黄姜乙醇提取物5％；NaNO₃ 0.3％；K₂HPO₄ 0.1％；FeSO₄ 0.001％；KCl 0.05％；MgSO₄·7H₂O 0.05％；pH值6.6。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固态浅盘发酵室外设有空气压缩泵，室外空气从空气压缩泵出来后，通过0.45μm滤膜过滤后，进入水浴锅，从水浴锅出来后变成无菌空气，通过通气管进入发酵室，然后分别通过穿孔通气管进入每个固态发酵架中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵室的出气口采用4层纱布过滤。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中各菌种的接种浓度为：里氏木霉的接种浓度为10⁶-10⁷个孢子/g，所述绿色木霉的接种浓度为10⁷-10⁸个孢子/g，所述烟曲霉的接种浓度为10⁷-10⁸个孢子/g，其中g为黄姜残渣重量。