[发明专利]鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株及其制备方法和应用。 

背景技术

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是一种可引起鸭产蛋下降、生长迟缓和死亡的黄病毒。2010年春季以来，上海市、江苏省、浙江省、安徽省等地相继爆发一种导致蛋鸭减产、肉鸭生长迟缓和死亡的一种新发病，研究证明引起该病的病原为坦布苏病毒(Tembusu virus)。该病毒对蛋鸭和肉鸭均有致病力，病鸭主要表现为高热、运动障碍、食欲下降甚至废绝、产蛋下降甚至停止，严重可导致死亡，死亡率可达5％-10％。据报道鸭坦布苏病毒病造成的经济损失已超过50亿元。 

鸭坦布苏病毒病在中国大陆首次发生，该病具有高度传染性，并且一年四季都可流行，给鸭坦布苏病毒病的防控带来了极大的困难，目前预防该病最有效的方法是疫苗免疫。但是，目前仍缺乏高效安全的防控鸭坦布苏病毒病的疫苗。 

发明内容

本发明要解决目前缺乏高效安全的防控鸭坦布苏病毒病疫苗的技术问题，提供一种鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株，该鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株是利用反向遗传操作技术获得的鸭坦布苏病毒强毒株FX2010的感染性克隆毒株，其不仅能用于研制新型鸭坦布苏病毒病疫苗，而且能用作病毒载体表达外源基因。 

此外，还需要提供一种上述鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株的制备方法和应用。 

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现: 

在本发明的一个方面，提供了一种鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株，该感染性克隆毒株是亲本毒鸭坦布苏病毒强毒株FX2010的克隆毒株，其具有SEQ ID NO.1所示的全基因序列，该感染性克隆毒株是通过反向遗传操作方法制得。 

优选的，所述反向遗传操作方法包括以下步骤： 

通过分段扩增、分段克隆、以及融合PCR，获得含有转录启动子序列的鸭坦布苏病毒强毒株FX2010的全长cDNA； 

将所述cDNA经体外转录获得RNA，再将该RNA转染细胞并从细胞上救获鸭坦布苏病毒强毒株FX2010的感染性克隆毒株。 

优选的，所述转录启动子为T7启动子。 

在本发明的另一方面，提供了一种重组载体，包含以下鸭坦布苏病毒强毒株FX2010全基因组序列中的部分核酸片段：SEQ ID NO.1序列中第3656-6353位核酸片段、第6216-9775位核酸片段、第9753-10991位核酸片段、第3656-9775位核酸片段、或第3656-10991位核酸片段。 

在本发明的另一方面，还提供了一种核酸分子，包括SEQ ID NO.1所示鸭坦布苏病毒强毒株FX2010全基因组序列的第1-1512位核酸片段、第1397-2896位核酸片段、第2643-4020位核酸片段、或SEQ ID NO.1序列5’端还加设有转录启动子的全基因序列。 

在本发明的另一方面，还提供了一种鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株的制备方法，包括以下步骤： 

分段扩增鸭坦布苏病毒全基因组的各DNA片段； 

将部分DNA片段分别克隆至载体，然后经亚克隆获得含有覆盖鸭坦布苏病毒基因组第3656-10991位核酸序列的重组载体； 

通过融合PCR获得含有转录启动子序列的鸭坦布苏病毒的全长cDNA； 

将所述cDNA经体外转录获得RNA，再将该RNA转染细胞并从细胞上救获鸭坦布苏病毒的感染性克隆毒株。 

在本发明的另一方面，还提供了一种上述鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株在制备预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗中的应用。 

在本发明的另一方面，还提供了一种上述鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株作为病毒载体的应用。 

在本发明的另一方面，还提供了一种重组鸭坦布苏病毒，该重组病毒是将上述鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株的E基因替换为鸭坦布苏病毒弱毒株的E基因而构建成的重组鸭坦布苏病毒。 

本发明鸭坦布苏病毒感染性克隆毒株，不仅能用于研制新型鸭坦布苏病毒病疫苗，而且能用作病毒载体表达外源基因，同时还为进一步研究鸭坦布苏病毒的基因组结构、功能、以及和病毒宿主相互作用机理提供重要的研究工具。 

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 

图1是本发明实施例1的FX2010株基因组全长cDNA构建策略示意图；