[发明专利]一种鲤疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法有效
申请号: | 201410282525.9 | 申请日: | 2014-06-23 |
公开(公告)号: | CN104032037A | 公开(公告)日: | 2014-09-10 |
发明(设计)人: | 潘晓艺;沈锦玉;蔺凌云;袁雪梅;郝贵杰;徐洋;姚嘉赟;尹文林 | 申请(专利权)人: | 浙江省淡水水产研究所 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68 |
代理公司: | 杭州浙科专利事务所(普通合伙) 33213 | 代理人: | 吴秉中 |
地址: | 313001 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 疱疹病毒 检测 试剂盒 及其 方法 | ||
技术领域
本发明属于病毒基因组检测技术领域,具体涉及一种鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvieus, CYHV) 检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
疱疹病毒为线性双链DNA病毒,可引起哺乳动物、禽类和水生动物多种致命性疾病,其中引起鱼类严重疾病的疱疹病毒主要有鮰疱疹病毒、鲤痘病毒(carp pox herpesvirus)、金鱼造血组织坏死病毒(haematopoietic necrosis herpesvirus of goldfish,HNHV)和锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus),后三者都属于鲤疱疹病毒,鲤痘病毒属于鲤疱疹病毒1型(Cyprinid herpesvirus 1, CYHV-1),金鱼造血组织坏死病毒属于鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CYHV-2),锦鲤疱疹病毒属于鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CYHV-3)。CYHV-1可引起鲤痘疮病,主要危害鲤鱼、鲫鱼及圆腹雅罗鱼等,影响鱼的生长,降低鱼的商品价值,可造成较大经济损失。CYHV-2可引起金鱼和鲫鱼的造血组织坏死症,该病于1992年在日本爱知县金鱼养殖场首次发现,之后在美国、中国台湾、澳大利亚等国和地区暴发并流行,其造成死亡率最高可达100%。2008-2013年造成中国最大的鲫鱼养殖基地江苏盐城地区养殖鲫鱼暴发鲤脾肾坏死病,造成几万亩的养殖鲫鱼死亡。而CYHV-3亦可引起鲤鱼和锦鲤的疱疹病毒病,一旦发病,死亡率达80%以上。由于以上三种鲤疱疹病毒病还未有有效疫苗可以用来预防,因此研制出以上三种鲤疱疹病毒病的检测试剂盒,是当前鲤科鱼类养殖需要解决的主要问题。
由于以上三种鲤疱疹病毒都可感染大部分的鲤科鱼类,又由于目前缺乏能同时检测以上三种鲤疱疹病毒的检测方法,这就给需要同时检测以上三种病原造成麻烦。本发明研制的能同时检测以上三种鲤疱疹病毒的PCR方法和套式PCR检测方法,弥补了该技术领域的缺陷,为以上三种鲤疱疹病毒的同时监测提供有力手段。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明的目的在于设计提供一种鲤疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法。该方法能同时检测鲤痘病毒(carp pox herpesvirus)、金鱼造血组织坏死病毒(haematopoietic necrosis herpesvirus of goldfish,HNHV)和锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)的基因组。该方法直观优越、敏感性好、特异性高,对检测微量、保存时间久的标本中鲤疱疹病毒基因组的效果良好,可用于鲤疱疹病毒感染的实验室检测和鲤疱疹病毒的分子流行病学调查。
为了达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
A、设计两对针对鲤疱疹病毒I型、II型和III型的通用引物
本发明中所设计的两对鲤疱疹病毒通用引物,从GenBank中获得鲤疱疹病毒科全部三个属代表株全基因组序列, Cyprinid herpesvirus 1 strain NG-J1, Cyprinid herpesvirus 2 strain ST-J1、Cyprinid herpesvirus 3 KHV-U共3株鲤疱疹病毒基因编码氨基酸序列和基因组全序列。将所有氨基酸序列和基因组全序列进行程序排列,寻找氨基酸序列及对应基因组序列均保守的区域作为引物设计区(见表1)。国内外尚未见能同时检测鲤疱疹病毒全部三个型通用引物设计的研究报道。
表1 鲤疱疹病毒引物设计
B、一种鲤疱疹病毒检测试剂盒,包括6个1.5mL的离心管,分别装有10×反应缓冲液,Taq酶(1U/μL),引物P1F/1R各10μM,引物P1F/P1R各10μM,纯水,阳性DNA(15μg/mL)。
所述的10×反应缓冲液的配方为:Tris-HCl 100mM,KCl 500mM,MgCl2 20mM,dNTPs 2.5mM。
C、鲤疱疹病毒基因组检测的方法
a、用病毒特异性DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)提取样本总DNA;
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