[发明专利]一种具有预防治疗动脉粥样硬化作用的蛋白功能多肽的酵母重组表达、纯化及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及oxLDL结合蛋白人血清β₂-糖蛋白I第五功能域的酵母重组表达、纯化及其在诊断预防和治疗动脉粥样硬化方面的应用。

背景技术

动脉粥样硬化（Athersclerosis，AS），随着人们生活水平的日益提高已成为威胁人类健康的重要因素。低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）的氧化产物，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）被认为是动脉硬化发生的主要诱发因子（C. K. Glass, and J. L. Witztum, Cell，2001）。oxLDL能够与血清中的β_2-糖蛋白I（β₂-glycoprotein I，β₂-GP I) 相结合并形成稳定的二元复合物，oxLDL/β₂-GP I二元复合物可作为一种自身免疫性抗原与系统性红斑狼疮SLE或抗磷脂综合症APS患者血清中的自身抗体形成三元复合物，经由巨噬细胞吞噬摄取形成泡沫细胞，从而导致自身免疫性动脉粥样硬化和血栓形成。

β₂-GPI也被称为apoliprotein H（apo H）, 主要由肝脏合成，在甘油三酯代谢中具有十分重要作用。β₂-GPI在血清中生理浓度为200μg/mL，该蛋白含有326 个氨基酸，分子量大约为 50KDa，由5 个结构域组成，其中第五结构域的C281KNKEKKC288区和S311-K317柔性环含有明显正电荷，能够与oxLDL的阴性电荷表位结构结合并形成复合物。研究发现，在SLE、APS或心梗患者血清及动脉粥样硬化巢内存在 oxLDL与β₂-GP I形成的二元复合物。目前，β₂-GP I结合oxLDL被认为是机体抗动脉粥样硬化的一种生物学保护作用，β₂-GP I与oxLDL结合是通过其第五功能结构域（DⅤ）来实现，因此酵母重组表达的β₂-GP I第五功能结构域（P.rβ₂-GP I-DV）很可能是阻断oxLDL致病作用的极好功能肽。

研究发现oxLDL上的阴性表位结构为7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷（oxLig-1），它介导了oxLDL与β₂-GP I的结合。导致β₂-GP I与oxLDL结合后使隐藏在其第一或第四结构域的抗原表位暴露，致动脉硬化血栓性自身抗体与oxLDL/β2-GPI复合物结合，形成免疫三元复合物，加速了巨噬细胞经由Fcγ受体吞噬摄取oxLDL形成泡沫细胞的进程，从而引起了自身免疫性动脉粥样硬化和血栓的发生。 酵母重组表达的β₂-GP I第五功能结构域（P.rβ₂-GP I-DV）通过竞争性结合oxLDL，抑制oxLDL/β2-GPI复合物形成以及与自身抗体形成三元复合物，达到预防和治疗动脉粥样硬化和血栓形成的目的。体外获得β₂-GP I第五功能结构域就显得十分必要，而要获得大量、高纯度及良好生物学活性的β₂-GP I第五功能结构域，酵母重组表达则成为最佳的手段。在本发明中，我们构建了β₂-GP I第五功能结构域的酵母表达载体，将其导入X-33酵母表达工程菌种，实现了β₂-GP I第五功能结构域在酵母系统中的表达，最终将获得的重组蛋白P.rβ₂-GP I-DV应用于抑制oxLDL的摄取、阻止泡沫细胞形成以及oxLDL诱导的炎症反应药物开发当中。 此类研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是建立了一整套P.rβ₂-GP I-DV酵母重组表达与纯化的体系，通过此体系能够高效获得具有结合阴性磷脂如心磷脂（CL）、oxLDL，oxLig-1等生物学活性的P.rβ₂-GP I-DV重组蛋白，并且证明了通过此系统获得的P.rβ₂-GP I-DV重组蛋白在生物学活性方面明显高于原核表达系统所表达的β₂-GP I第五功能结构域重组蛋白（E.rβ₂-GP I-DV）；