[发明专利]一种具有预防治疗动脉粥样硬化作用的蛋白功能多肽的酵母重组表达、纯化及应用

权利要求书

1.P.rβ₂-GPⅠ-DV重组蛋白将血清中稳定存在的oxLDL/β₂-GPⅠ二元复合物打开的用途，所述用途是非治疗目的，所述的P.rβ₂-GPⅠ-DV是指酵母重组表达的β₂-GPⅠ第五功能结构域重组蛋白，P.rβ₂-GPⅠ-DV重组蛋白的制备方法如下：

一、将β₂-GP I序列根据下列的要求进行合成，上游引物序列包括：5’端含有保护碱基、XhoI酶切位点、信号肽识别位点以及β₂-GPⅠ第五功能结构域 5’端部分氨基酸编码基因序列；下游引物序列包括：5’端含有保护碱基、Xbal I酶切位点、终止密码子、6个His，GGGGS 柔性肽以及β₂-GPⅠ第五功能结构域3’端部分氨基酸编码基因的互补序列，具体上下游引物序列如下：

上游引物：

5’-CCGCTCGAGAAAAGAAAAGCATCTTGTAAAGTACCTGTG-3’ 39bp

下游引物：

5’-GCTCTAGATTATCAATGATGATGATGATGATGGGAACCACCACCACCGCATGGCTTTACATCGGA-3’ 65bp

二、表达P.rβ₂-GPⅠ-DV的酵母重组菌株的构建过程如下：

（1）β₂-GPⅠ第五功能结构域基因片段的获得：

以含有β₂-GPⅠ片段的T载体为模板，使用上游引物和下游引物对β₂-GPⅠ-DV基因进行PCR扩增，PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，之后将目标条带切下并由凝胶回收试剂盒回收得到β₂-GPⅠ第五功能结构域的基因片段；

（2）酵母表达质粒pPICZαA-DV的构建

1）β₂-GPⅠ第五功能结构域基因片段的TA克隆

将β₂-GPⅠ第五功能结构域基因片段连接至pMD19-T simple vector，连接体系为：pMD 19-T Simple Vector ，0.03 pmol 1μL；目的基因，0.303 pmol 2 μL；H₂O ，2μL ；Solution ，5μL，之后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，涂布于含有抗性的LB平板，获得的菌落进行PCR鉴定，并挑选阳性克隆扩大培养后进行测序，测序结果与人的β₂GPⅠ-DV序列比对，鉴定序列与其一致正确后将重组质粒命名为pMD19-T-β₂-GPⅠ-DV；

2） 重组表达载体的构建及鉴定

将含有pMD19-T-β₂-GPⅠ-DV及pPICZαA质粒的大肠杆菌JM109分别扩大培养并进行质粒提取，之后用Xbal I、 Xho I进行双酶切，切胶回收酶切产物β₂-GPⅠ第五功能结构域基因片段和pPICZαA目的片段，连接16 h 以上，得到连接产物，将连接产物转化JM109感受态细胞，涂布到含有氨苄抗性的Low salt LB固体培养基，培养16 h后挑选阳性菌落进行扩大培养，并进行质粒提取及Xbal I、 Xhol双酶切鉴定，将构建成功的重组表达质粒命名为pPICZαA-β₂-GPⅠ-DV；

(3)P.rβ₂-GPⅠ-DV酵母重组表达菌株的构建

1)pPICZαA-β₂-GPⅠ-DV质粒电转化毕赤酵母X-33

提取pPICZαA-β₂-GPⅠ-DV质粒，并进行SacI单酶切，将5-10μg酶切产物经乙醇沉淀后溶于10μL超纯水中，与80μL当日制备的X-33感受态细胞混匀并转移至1cm电转杯中，冰上孵育5min，冰育后使用Bio-rad电转化仪进行电转，转化的条件为：电压2000 V，电阻200Ω，电激时间4-5 ms，电激完毕，立即在电转杯中加入1 mL 冰冷的1 M 山梨醇， 28℃孵育1h，之后加入1mL YPD培养基，28℃震荡培养1h，将培养液离心浓缩后涂于含有抗性的YPD固体培养基，28℃培养72h；

2）原位双膜法快速筛选阳性表达菌株

在BMMY平板上置一同样大小的NC膜，并将菌落点于膜上，30 ℃倒置孵育48h，期间在盖子上每日补加1mL甲醇和1mL水，将醋酸纤维素薄膜置于NC膜上，用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡，使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上以做菌落备份，将NC膜取下，冲去菌落，沸水中煮5min，5 %脱脂奶粉37 ℃封闭1h，TBST洗3 次，每次10min，一抗抗体为抗HIS-tag，室温孵育2 h , TBST 洗膜3次，二抗室温孵育1h ，TBST 洗膜3次， ECL显色，并于暗室中显影，使用Quantity One软件对显影胶片进行灰度比较，筛选得到重组蛋白高表达量阳性菌株，即为表达P.rβ₂-GPⅠ-DV的酵母重组菌株；

（4）P.rβ₂-GPⅠ-DV在毕赤酵母X-33中的诱导表达及纯化

使用BMGY-BMMY 培养基体系，将筛选得到的阳性菌株接种到1L BMGY培养基中，28℃培养36h；1500rpm离心菌液，弃上清，加入100mL含有1%甲醇的BMMY培养基，28℃诱导表达96h，每隔24h补加1%甲醇，P.rβ₂-GPⅠ-DV重组蛋白为分泌表达形式存在，将发酵液4℃、6000rpm离心30min后收集上清液，取少量上清液-80℃保存，其余皆调节pH到8.0，0.45μm滤膜过滤上清液后，镍离子亲和层析柱纯化蛋白，所得到的纯化蛋白经超滤浓缩后，进行 SDS-PAGE电泳分析及Western-blot鉴定，能见明显目标条带，证明重组蛋白纯化成功。