[发明专利]一种密码子植物化改造的PMI基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种密码子经过植物化改造的PMI基因，及其作为筛选标记，在植物遗传转化方面的应用。

背景技术

转基因技术，是20世纪80年代初发展起来的一种有效的植物定向改良方法。该技术主要通过农杆菌介导、基因枪转化等方法将目的基因导入受体，经过标记筛选和分子检测，获得稳定表达的转化体，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。

但现有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记，该类基因可能随食物进入肠道,存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。

而PMI是一种糖代谢基因，广泛存在于藻类和一些豆科植物中。水稻等高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏PMI，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用，因此PMI可以作为筛选标记基因。与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达PMI基因，可以利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率高。同时，甘露糖是广泛存在于海藻、蕨类等植物中的己糖，且PMI的催化产物为6-磷酸果糖，是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。

但现在使用的PMI是从原核生物大肠杆菌中分离出来的，而原核生物和真核生物存在不同的密码子偏好和碱基组成。例如以水稻为代表的单子叶植物，其GC含量高，较细菌及双子叶植物等物种，密码子偏好性强。因此直接使用未经人工优化设计的PMI，会影响其在真核细胞中的表达效率，并影响其作为筛选标记的使用效果。此外，由于PMI来自于大肠杆菌，可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。

发明内容

针对上述问题，本发明希望对PMI进行密码子植物化改造。本发明旨在将PMI基因对密码子经过植物化改造，并作为筛选标记，应用于植物遗传转化。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种密码子植物化改造的PMI基因，命名为plant PMI，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该序列是以模式作物水稻密码子偏好进行优化，即在维持编码氨基酸序列不变的前提下，用水稻偏好密码子替换原有密码子，得到植物化改造的plant PMI序列，再经过化学合成而来。

在第二个方面，本发明提供一种含有所述plant PMI基因的植物表达载体。构建方法是利用Xho I酶切位点，用Xho I酶切pCAMBIA1381载体并回收，由于合成的plant PMI序列两端加有Xho I酶切位点，可以利用T₄连接酶将plant PMI连接到pCAMBIA1381载体，得到植物表达载体pCAMBIA1381-plant PMI。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的PMI基因。

另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述密码子植物化改造的PMI基因作为筛选标记，获得转基因植物或植物部分。

优选地，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。

优选地，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。

在另一个方面，本发明提供一种利用pCAMBIA1381-plant PMI表达载体(其含有所述密码子植物化改造的PMI基因)，将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带plant PMI筛选标记基因的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；