[发明专利]一种用于血液中全基因组DNA提取试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从血液中提取全基因组DNA的试剂盒及利用其从血液中提取全基因组DNA的方法。本发明所述试剂盒提取血液中全基因组DNA时，不用事先对血液中进行血浆和血清分离，只需取新鲜或冰冻的抗凝全血，最低需要的血量可达到20μl或者血斑即可。其高效提取获得的高纯度的全基因组DNA，可用于PCR扩增、基因表达、基因测序、全基因组测序、外显子组测序、基因突变和单核苷酸多态性等科研或临床诊断分析。。 

背景技术

全基因组DNA(genomic DNA，gDNA)为单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部基因信息。所有的生命信息均可以从全基因组DNA中发现，包括与疾病密切相关的基因表达、基因突变和单核苷酸多态性等问题。从基因水平分析可以早发现、早诊断所用疾病的发生，在分子遗传学和临床检测中DNA检查已有逐步取代血清学检查(ELISA检测)。因而，荻取全基因组DNA是所有相关的科研和临床检测的第一步，高效率提取获得高纯度的全基因组DNA是至关重要的。 

目前经典基因组DNA提取方法主要分为4个步骤：1.使用淋巴细胞分离液梯度离心分离得到血液中白细胞，或者直接低渗透裂解红细胞后离心收集白细胞；2.使用细胞裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，如高氯酸钠法、SDS法、NaI法和尿素提取法等；3.有机溶剂抽提去除蛋白质和血红素等杂质，即酚/氯仿抽提；4.用乙醇沉淀或透析等沉淀分离DNA。该方法具有提取的DNA纯度高、蛋白质和血红素等杂质少的优点，但该方法需要的血液样本大，残留DNA溶液中含有酚类等有机物质对DNA聚合酶有抑制作用，特别是在PCR扩增过程中会对扩增过程产生抑制作用。另外，酚、氯仿和异丙醇等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者健康，使得该方法的应用受到一定的限制。 

基因组DNA非有机溶剂提取法采用细胞裂解液使白细胞释放DNA，使用蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶K和核糖核酸酶和强碱(NaOH或KOH)等对蛋白质和RNA进行允分消化分解。在高盐的条件下用乙醇直接沉淀分离纯化DNA。该方法避免了使用有毒作用的有机溶剂，提取的DNA纯度较高和提取效率高，但其需要的血量大，单独使用蛋白酶消化时间很长，可能对白细胞裂解不充分，另外使用强碱对操作者健康不利，也可能影响后续PCR扩增效率。 

硅胶膜离心吸附柱方法利用硅胶膜特异性吸附DNA能力，通过漂洗取出蛋白质和其他杂质，后用低盐溶液洗脱得到基因组DNA，操作中未用到酚、氯仿等有机溶剂以及强碱，但用离心柱提取的gDNA容易产生拖尾，表明其提取的gDNA纯度不高，或有降解的产生。 

血液中全基因组DNA提取方法必须减少有机溶剂或强碱对操作者健康和后续实验的影响，在微量的血液样本时也能高效提取全基因组DNA，因此，使用高效裂解白细胞和纯化gDNA以及不进行血清和血浆分离的试剂盒，对高效提取高纯度全基因DNA具有广泛应用价值。 

发明内容

本发明提供一种从血液中高效地提取全基因组DNA的试剂盒及其从血液中提取全基因组DNA的方法，用以解决减少有机溶剂或强碱对操作者健康和后续实验的影响等问题，即使在微量的血液样本时也能高效提取得到高纯度的全基因组DNA。 

通过发明人多年来对上万例临床血液样本的提取全基因组DNA工作经验和技术改进，发现在含有1mol/L Tris-HCl(pH值8.0)，0.5mol/L EDTA(pH值8.0)，0.2mol/LNaCl，10％SDS的消化液中添加20mg/ml蛋白酶K，处理后能高效地裂解白细胞，可以分解与DNA结合在一起的核蛋白，使DNA被游离释放在消化液中。也发现采用LiCl可沉淀糖类、脂类、大量蛋白质和高分子RNA，在向水浴过夜后白细胞的裂解混合液中加入含7.5mol/L LiCl的纯化液可大量去除糖类、脂类、蛋白质和高分子RNA等杂质，该过程无需再使用RNA酶消化处理，即可去除大量RNA。 

本发明采用价格廉价的预冷无水乙醇即可析出大量全基因组DNA，不需要通过有机溶剂进行抽提。并且应用80％乙醇的洗涤液进行洗涤和含1mol/LTris-HCl(pH值8.0)，0.5mol/L EDTA(pH值8.0)的洗脱液进行洗脱，将获得高纯度的全基因组DNA。因而，在此基础上研发可高效从血液中提取高纯度的全基因组DNA的试剂盒及其方法。 

本发明所提供的一种血液中全基因组DNA提取试剂盒，其特征在于各组成分别为： 

1)红细胞裂解液：灭菌的去离子超纯水(电阻率大于18MΩ*cm)，400ml/瓶；