[发明专利]一种虫草抗菌肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种虫草抗菌肽及其制备方法。

背景技术

抗菌肽是生物体免疫系统为抵御外源性病原微生物入侵而产生的一类多肽物质，是先天免疫的重要组成成分。目前，在抗菌肽数据库(Antimicrobial Peptide Database，APD)中已经有2353条抗菌肽，其中有215个细菌素，305个植物抗菌肽，12个真菌抗菌肽和1773个动物宿主防御肽。

由于抗菌肽能够抑制革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、病毒及寄生物等。此外，抗菌肽还对免疫系统具有调控作用。相比传统抗生素抗菌肽具有抗菌谱广、热稳定性好、杀菌快速、作用专一、多样化的应用潜力以及不易产生耐药性等优点。因此，抗菌肽有望成为新型的抗菌药物。目前，已有几种抗菌肽进入临床研究，多种抗菌肽应用于食品保鲜以及饲料添加剂。

抗菌肽的分布极为广泛，在病毒、细菌到植物、昆虫、软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物中均有发现。具体的，抗菌肽是由基因编码的一类多肽。所有抗菌肽均是由一段包含信号序列的前体翻译后修饰而来。在不同生物体内，分泌抗菌肽的部位不尽相同，抗菌肽的氨基酸组成也相差甚远。根据其氨基酸组成及结构特点，一般将抗菌肽分为以下五种类型：线性阳离子α-螺旋抗菌肽、富含特殊氨基酸的阳离子抗菌肽、含有二硫键的抗菌肽、阴离子抗菌肽、大型蛋白质的片段。α-螺旋型抗菌肽是其中一大类，在自然界广泛存在，它们与细菌细胞膜互作，依静电引力靠近并结合在质膜表面，随之疏水结构域插入质膜中，当抗菌肽达到一定浓度后，通过分子聚集和膜内分子间相互位移破坏细胞膜稳定性，增加膜通透性，形成离子通道，引起去极化；或形成较大通道，使细胞内容物外泄，最终导致细胞死亡。

蛹虫草是药食两用的新资源食品，是唯一实现规模化人工种植的虫草真菌。研究表明，虫草多肽在毫克水平就能发挥作用，安全评价药理和功能检测结果也证明虫草多肽无毒、无副作用、营养价值和生物利用率均极高。因此，以蛹虫草为研究材料，制取虫草多肽，并进行应用是相关领域中的研究热点。

在相关技术中，通常利用碱性蛋白酶水解蛹虫草子座热水浸提虫草素后的剩余物；再通过电泳进行分离纯化，获得分子量在3180～5620之间的多肽混合物。这些多肽混合物虽具有一定的清除自由基、抗脂质过氧化的能力；但是，均不能体现出抑菌活性。进而严重了限制了其推广应用。

综上，以蛹虫草为了来源，制取一种具有抑菌活性的虫草抗菌肽是本领域亟待解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虫草抗菌肽及其制备方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种虫草抗菌肽，其从蛹虫草菌株中分离得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；经过抗菌实验测定，其对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌作用，体现出了抑菌活性，实现了从蛹虫草中获取具有抑菌活性的抗菌肽的技术效果，进而可进行全面的推广应用。

本发明的实施例中提供的这种虫草抗菌肽的制备方法具体包括以下步骤：

步骤A：将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中，培养至产生斜面孢子；利用无菌水将得到的所述斜面孢子洗下，并转接到三角瓶中，振荡培养，得到孢子悬液；

步骤B：将所述孢子悬液转接到萨氏液体培养基中，恒温振荡培养之后静置、过滤，得到菌丝体；

步骤C：将所述菌丝体烘干至粉末状后加入蒸馏水，提取过夜后过滤，得到滤液；

步骤D：将所述滤液进行旋转蒸发浓缩，并同时加入饱和硫酸铵溶液，静置后离心，得到第一浓缩液，在所述第一浓缩液中再次加入饱和硫酸铵溶液，得到预定饱和度的第二浓缩液，将所述第二浓缩液离心，得到沉淀样品，在所述沉淀样品中加入蒸馏水进行溶解，得到样品溶解液；将所述样品溶解液利用蒸馏水透析后冷冻干燥，得到粗蛋白样品；

步骤E：将所述粗蛋白样品利用CM-52阳离子交换柱进行洗脱，得到洗脱组份，再将洗脱组份透析后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到14KD的蛋白质条带；

步骤F:切下所述蛋白质条带，并进行液质联用质谱检测，得到质谱数据，并进行分析，得到虫草抗菌肽及其序列。

通过发明实施例提供的这种制备方法可实现以蛹虫草菌株为来源，获得具有抑菌活性的虫草抗菌肽。

可选的，在步骤A中：所述萨氏琼脂改良固体培养基，按照重量份数计，其有效组份包括：

麦芽糖4-6份、蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、琼脂18-22份、葡萄糖18-22份、水900-1100份。

可选的，在步骤A中：